構(gòu)建外源基因通常有兩種方案躲因，一是目的基因接綠色熒光蛋白（GFP)或紅色熒光蛋白（RFP），二是在目的基因上帶一個(gè)標(biāo)簽蛋白（如His或Flag等）。
GFP重組蛋白：
1睹簇、GFP蛋白分子量比較大，如與目的基因形成融合蛋白也許會(huì)影響目的蛋白的功能寥闪，其優(yōu)點(diǎn)是便于觀察太惠。
2、GFP疲憋，CFP凿渊，YFP tagging：適合于觀察 蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位，不適合用于一般的蛋白實(shí)驗(yàn)缚柳，因?yàn)楸旧泶笮《荚?5kda左右埃脏，而且這樣的熒光質(zhì)粒的蛋白表達(dá)量，相比要小一些秋忙。
含標(biāo)簽蛋白的重組蛋白：
1彩掐、標(biāo)簽蛋白通常只有幾個(gè)氨基酸，其與目的基因結(jié)合一般不會(huì)影響目的蛋白的功能灰追，而且市場(chǎng)化的標(biāo)簽抗體可用來(lái)檢測(cè)外源基因的表達(dá)或純化堵幽。
2狗超、His, Myc, Flag, HA 標(biāo)簽： 由于本身大小只有 2kda左右，不會(huì)影響蛋白作用朴下，而且努咐，一般所選用的promotor也比較強(qiáng)，蛋白表達(dá)量也很多殴胧，足夠一般的任何生物實(shí)驗(yàn)麦撵，一般用于蛋白相互作用等試驗(yàn)。一般不能用于定位溃肪。
3免胃、推薦：sigma --> Flag, santa cluz--> HA
注：參考丁香園相關(guān)網(wǎng)站匯總。
- HIS標(biāo)簽：
主要應(yīng)用：His標(biāo)簽融合蛋白也被用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)惫撰、蛋白質(zhì)-DNA相互作用研究
優(yōu)缺點(diǎn)：1.標(biāo)簽的分子量小
2.可在非離子型表面活性劑存在/變性條件下純化羔沙，前者在純化疏水性強(qiáng)的蛋白得到應(yīng)用，后者在純化包涵體蛋白時(shí)特別有用厨钻；
3.可應(yīng)用于多種表達(dá)系統(tǒng)扼雏，純化的條件溫和；
4.可以和其它的親和標(biāo)簽一起構(gòu)建雙親和標(biāo)簽夯膀。
5诗充、免疫原性相對(duì)較低； - Flag-tag標(biāo)簽：
主要應(yīng)用： 廣泛的應(yīng)用于蛋白表達(dá)诱建、純化蝴蜓、鑒定、功能研究及其蛋白相互作用等相關(guān)領(lǐng)域俺猿，在真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)效率更高茎匠。
優(yōu)缺點(diǎn)：1.其通常不會(huì)與目的蛋白相互作用，便于研究人員對(duì)融合蛋白進(jìn)行下游研究押袍。
2.其目的蛋白诵冒，可直接通過(guò)FLAG進(jìn)行親和層析，此層析為非變性純化谊惭，可以純化有活性的融合蛋白汽馋，并且純化效率高。
3.其可以被抗FLAG的抗體識(shí)別圈盔，便通過(guò)Western Blot豹芯、ELISA等方法對(duì)含有FLAG的融合蛋白進(jìn)行檢測(cè)、鑒定药磺。
4.融合在N端的FLAG告组，其可以被腸激酶切除（DDDK），從而得到特異的目的蛋白癌佩。 - GST 標(biāo)簽：
主要應(yīng)用：GST融合表達(dá)系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于各種融合蛋白的表達(dá)木缝，可以在大腸桿菌和酵母菌等宿主細(xì)胞中表達(dá)便锨。
優(yōu)缺點(diǎn)： 1、它是一個(gè)高度可溶的蛋白我碟；
2放案、它可在大腸桿菌中大量表達(dá)，起到提高表達(dá)量的作用矫俺。
3吱殉、在大多數(shù)情況下，融合蛋白在水溶液中是可溶的厘托，并形成二體友雳。GST標(biāo)簽可用酶學(xué)分析或免疫分析很方便的檢測(cè)。標(biāo)簽有助于保護(hù)重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其穩(wěn)定性铅匹。在大多數(shù)情況下GST融合蛋白是完全或部分可溶的押赊。 - c-Myc 標(biāo)簽：
主要應(yīng)用：應(yīng)用在 Western-blot雜交技術(shù)、免疫沉淀和流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)中, 可用于檢測(cè)重組蛋白質(zhì)在靶細(xì)胞中的表達(dá)包斑。 含11個(gè)氨基酸作為抗原表位表達(dá)在不同的蛋白質(zhì)框架中仍可識(shí)別其相應(yīng)抗體流礁。 - 熒光素酶標(biāo)簽：
主要應(yīng)用： 常用于研究啟動(dòng)子、miRNA 3'UTR克隆的功能與調(diào)控
優(yōu)缺點(diǎn)： 1.靈敏度高罗丰，檢測(cè)幅度寬神帅；
2.不是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)源性基因；
3.重復(fù)性好萌抵；
4.與HTS兼容等找御。
該如何選擇表達(dá)克隆的標(biāo)簽
1、首先谜嫉，需要確定融合標(biāo)簽的目的
- 蛋白純化 ：標(biāo)簽的普遍用途是蛋白純化萎坷。小分子6XHis Tag常被用于細(xì)胞內(nèi)源蛋白的純化凹联。6XHis Tag也廣泛應(yīng)用于大腸桿菌的蛋白純化沐兰。可是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中因非分泌蛋白自身存在高組氨酸背景蔽挠，因此極少使用6XHis Tag住闯。
- Western Blot檢測(cè)：若需要做Western Blot實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞裂解物中蛋白的表達(dá)，你可以選擇有匹配的抗體的小分子標(biāo)簽澳淑。FLAG? Tag以其分子量小以及擁有許多與之匹配的商業(yè)化的抗體等優(yōu)勢(shì)比原，成為Western Blot實(shí)驗(yàn)中常用的Tag。
- 免疫沉淀反應(yīng)：FLAG? Tag其分子量小以及擁有大量相匹配的商業(yè)用抗體等優(yōu)勢(shì)成為免疫沉淀反應(yīng)中最常用的Tag. 其他常用的標(biāo)簽有：HA和cMyc.
- 活細(xì)胞成像：熒光蛋白（Fluorescent Proteins, FPs）是活細(xì)胞成像常用的標(biāo)記蛋白杠巡。其中最常用的是綠色熒光蛋白（GFP）和它的衍生物（CFP, YFP, etc.）量窘，以及一些紅色變體，如dTomato和mCherry.
2氢拥、考慮融合標(biāo)簽的影響
任何一類標(biāo)簽處于氨基酸序列的任一位置蚌铜，都具有影響目的蛋白表達(dá)或功能的可能性锨侯。最主要原因是標(biāo)簽可能會(huì)干擾蛋白的正確折疊，致使目的蛋白失活或形成包涵體冬殃。其次囚痴，標(biāo)簽可能會(huì)中斷亞細(xì)胞定位信號(hào)，這種情況下审葬，蛋白能夠正確翻譯和折疊深滚，但在細(xì)胞內(nèi)所處的位置是錯(cuò)誤的。因此涣觉，您需要知道添加的標(biāo)簽對(duì)目的蛋白的表達(dá)是否有影響痴荐。
3、考慮是在N-端還是C-端標(biāo)記
N-端或C-端標(biāo)記的選擇還需要根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)官册、定位等特性蹬昌。然而，倘若你沒(méi)有確切的蛋白結(jié)構(gòu)攀隔，或蛋白功能域圖譜皂贩，建議分別構(gòu)建N-端標(biāo)記和C-端標(biāo)記的表達(dá)克隆，以檢測(cè)哪個(gè)更有效昆汹。
參考：https://zhuanlan.zhihu.com/p/29096502
