scATAC文獻(xiàn)：利用scRNA-seq和scATAC-seq研究靈長類中間神經(jīng)元發(fā)育過程中的進(jìn)化保守和非保守調(diào)控
INTRODUCTION
人腦復(fù)雜有序的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)主要由興奮性谷氨酸神經(jīng)元和含?-氨基丁酸（GABA能）的抑制性中間神經(jīng)元組成则拷。中間神經(jīng)元是高度多樣的神經(jīng)元吃谣，具有不同的形態(tài)缩幸、連接性和生物學(xué)功能铸抑。興奮/抑制平衡失調(diào)與許多神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)精神障礙有關(guān)准颓，如自閉癥譜系障礙和精神分裂癥。在大腦發(fā)育過程中搔体，只有少數(shù)中間神經(jīng)元起源于局部區(qū)域并發(fā)揮作用剧腻，而幾乎所有其他中間神經(jīng)元都來自神經(jīng)節(jié)隆起（GEs），即胚胎階段的暫時(shí)性結(jié)構(gòu)隔嫡。位于丘腦和尾狀核之間的GEs是中間神經(jīng)元的起源甸怕。GEs可分為三個(gè)亞區(qū)甘穿，包括外側(cè)、內(nèi)側(cè)和尾側(cè)神經(jīng)節(jié)隆起（LGE梢杭、MGE和CGE）温兼。
每個(gè)亞區(qū)表達(dá)特定的基因，并產(chǎn)生針對(duì)整個(gè)大腦的時(shí)間和空間上不同的中間神經(jīng)元武契。MGE主要產(chǎn)生遷移至大腦皮質(zhì)募判、紋狀體和蒼白球的GABA能細(xì)胞，其特征是NKX2-1和LHX6的表達(dá)咒唆。LGE衍生的中間神經(jīng)元主要由紋狀體中棘神經(jīng)元（MSN）和嗅球中間神經(jīng)元的前體組成届垫，可分別通過ISL1和CHD7的表達(dá)來識(shí)別。CGE主要產(chǎn)生5HT3aR+皮質(zhì)中間神經(jīng)元钧排，具有NR2F1和NR2F2的特異性表達(dá)敦腔。GE發(fā)育過程中基因和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的特異性表達(dá)有助于區(qū)域細(xì)胞多樣性和神經(jīng)元間遷移。
單細(xì)胞RNA-seq已被應(yīng)用于發(fā)育神經(jīng)科學(xué)的研究中恨溜。與從組織中生成混合表達(dá)數(shù)據(jù)的傳統(tǒng)bulk RNA-seq相比，scRNA-seq可以提供單個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜找前。具有如此高分辨率的技術(shù)可以區(qū)分不同的細(xì)胞類型糟袁，并促進(jìn)我們對(duì)復(fù)雜神經(jīng)系統(tǒng)的研究。
對(duì)小鼠的幾項(xiàng)單細(xì)胞研究揭示了胚胎發(fā)育過程中GE中間神經(jīng)元的分子和轉(zhuǎn)錄特征的多樣性躺盛。然而项戴，關(guān)于靈長類動(dòng)物GE發(fā)育過程中抑制性神經(jīng)元生成的研究很少，由于缺乏或缺乏高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄分析槽惫，嚙齒類動(dòng)物和靈長類動(dòng)物之間的保護(hù)性和異質(zhì)性仍然有限周叮。此外，復(fù)雜的細(xì)胞增殖界斜、空間差異仿耽、譜系決定和中間神經(jīng)元遷移背后的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍不清楚。
在這項(xiàng)研究中各薇，我們使用scRNA-seq和單細(xì)胞分析技術(shù)项贺，通過高通量測序（scATAC-seq），這項(xiàng)技術(shù)能夠捕獲染色質(zhì)上的開放區(qū)域峭判，以研究人類和獼猴胚胎中GEs的轉(zhuǎn)錄軌跡开缎。我們發(fā)現(xiàn)，在人類和獼猴之間發(fā)育的GEs中林螃，大多數(shù)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)都很保守奕删，包括參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞命運(yùn)決定和遷移的網(wǎng)絡(luò)疗认。我們在不同的人類GE區(qū)域發(fā)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞命運(yùn)決定可能重要的基因完残。此外伏钠，我們還發(fā)現(xiàn)了新的調(diào)控途徑，可能與MGE和LGE的命運(yùn)決定以及GEs中的細(xì)胞遷移有關(guān)坏怪。重要的是贝润，在人類發(fā)育中的GEs中證實(shí)了外放射狀膠質(zhì)細(xì)胞(outer radial glial cells)的存在。
RESULTS
Cell diversity in the early developmental stages of primate GEs
為了研究和比較靈長類GEs的發(fā)育特征铝宵，我們對(duì)三只食蟹猴和兩個(gè)人類胎兒的GEs進(jìn)行了基于液滴的scRNA-seq分析打掘。獼猴樣本來自第7周、第10周和第12周鹏秋，當(dāng)時(shí)GEs仍處于早期發(fā)育階段尊蚁。從可能處于可比發(fā)育窗的GW 9和GW 13中采集人類樣本（圖1a）。
在測序侣夷、作圖和質(zhì)量控制之后横朋，我們從人類獲得13782個(gè)細(xì)胞，從獼猴獲得29269個(gè)細(xì)胞百拓。然后琴锭，來自兩個(gè)物種的數(shù)據(jù)被Seurat3整合。使用無監(jiān)督方法對(duì)不同的細(xì)胞進(jìn)行聚類（圖1b）衙传，我們檢測到21個(gè)細(xì)胞簇决帖。每個(gè)簇都用已知的 marker進(jìn)行注釋，用于對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行分類（圖1b）蓖捶。
我們從鄰近的大腦皮層中移除了兩簇表達(dá)NRN1和SLA46,47的興奮性神經(jīng)元地回。我們還發(fā)現(xiàn)，通過相應(yīng)的標(biāo)記物CX3CR1和SLC4A1識(shí)別的小膠質(zhì)細(xì)胞和血細(xì)胞簇也被移除俊鱼。在剩余的GE衍生細(xì)胞中刻像，我們可以通過差異基因表達(dá)分析將細(xì)胞與GE祖細(xì)胞和有絲分裂后細(xì)胞區(qū)分開來。包括放射狀膠質(zhì)細(xì)胞（RGCs）和GEs中間祖細(xì)胞（IPCs）在內(nèi)的神經(jīng)祖細(xì)胞表現(xiàn)出NES并闲、VIM或ASCL1细睡、DLL150的高表達(dá)水平（圖1c、d）焙蚓。
TOP2A51可以標(biāo)記細(xì)胞周期中的增殖細(xì)胞（圖1c纹冤，d）。有絲分裂后的細(xì)胞可以通過區(qū)域特異性標(biāo)記進(jìn)一步定義（圖1c）购公。MGE由特異性表達(dá)NKX2-1和LHX6的細(xì)胞組成萌京，而MEIS2、ISLR2在LGE中表達(dá)宏浩，NR2F1知残、NR2F2在CGE中表達(dá)（圖1d）。然后比庄，我們計(jì)算了每種細(xì)胞類型的人類和獼猴細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞比率求妹，這在river plot中可見乏盐，表明人類和獼猴的GE細(xì)胞分區(qū)之間沒有顯著差異（圖1e）≈苹校基于人類和獼猴不同細(xì)胞類型之間基因表達(dá)的相似性分析也證明了整合這兩個(gè)物種數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性（圖1f）父能。
為了展示靈長類GEs細(xì)胞發(fā)育的軌跡，我們進(jìn)行了RNA速度分析（scVelo）净神，這是一種通過重建轉(zhuǎn)錄變化的發(fā)育序列來推斷軌跡的方法何吝。正如所預(yù)測的，來自GE祖細(xì)胞的細(xì)胞增殖并生成IPCs鹃唯，然后分化成MGE爱榕、LGE和CGE中的各種譜系（圖1g）∑禄牛總之黔酥，我們的分析證實(shí)了獼猴和人類之間的基本進(jìn)化保守性，并揭示了人類和獼猴的細(xì)胞多樣性和發(fā)育軌跡洪橘。
