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第二章：生物信息分析

第一節(jié)：解讀sam格式文件

1型凳，SAM文件格式介紹

SAM（The Sequence Alignment / Map format）格式瀑凝，即序列比對(duì)文件的格式目锭，詳細(xì)介紹文檔：http://samtools.github.io/hts-specs/SAMv1.pdf

SAM文件由兩部分組成浪默，頭部區(qū)和主體區(qū)喉童，都以tab分列者填。

頭部區(qū)：以’@'開始忌堂，體現(xiàn)了比對(duì)的一些總體信息证舟。比如比對(duì)的SAM格式版本颂暇，比對(duì)的參考序列缺谴，比對(duì)使用的軟件等。

主體區(qū)：比對(duì)結(jié)果耳鸯，每一個(gè)比對(duì)結(jié)果是一行湿蛔，有11個(gè)主列和一個(gè)可選列。

2县爬，頭部區(qū)簡要介紹

@HD VN:1.0 SO:unsorted （排序類型）

頭部區(qū)第一行：VN是格式版本煌集；SO表示比對(duì)排序的類型，有unknown（default）捌省，unsorted苫纤，queryname和coordinate幾種。samtools軟件在進(jìn)行行排序后不能自動(dòng)更新bam文件的SO值，而picard卻可以卷拘。

@SQ SN:contig1 LN:9401 （序列ID及長度）

參考序列名喊废，這些參考序列決定了比對(duì)結(jié)果sort的順序，SN是參考序列名栗弟；LN是參考序列長度污筷；每個(gè)參考序列為一行。

例如：@SQ SN:NC_000067.6 LN:195471971

@RG ID:sample01 （樣品基本信息）

Read Group乍赫。1個(gè)sample的測序結(jié)果為1個(gè)Read Group瓣蛀；該sample可以有多個(gè)library的測序結(jié)果，可以利用bwa mem -R 加上去這些信息雷厂。

例如：@RG ID:ZX1_ID SM:ZX1 LB:PE400 PU:Illumina PL:Miseq

ID：樣品的ID號(hào) SM：樣品名 LB：文庫名 PU：測序以 PL：測序平臺(tái)

這些信息可以在形成sam文件時(shí)加入惋增，ID是必須要有的后面是否添加看分析要求

@PG ID:bowtie2 PN:bowtie2 VN:2.0.0-beta7 （比對(duì)所使用的軟件及版本）

例如：@PG ID:bwa PN:bwa VN:0.7.12-r1039 CL:bwa sampe -a 400 -f ZX1.sam -r @RG ID:ZX1_ID SM:ZX1 LB:PE400 PU:Illumina PL:Miseq …/0_Reference/Reference_Sequence.fa ZX_HQ_clean_R1.fq.sai ZX_HQ_clean_R2.fq.sai …/2_HQData/ZX_HQ_clean_R1.fq …/2_HQData/ZX_HQ_clean_R2.fq

這里的ID是bwa，PN是bwa改鲫，VN是0.7.12-r1039版本诈皿。CL可以認(rèn)為是運(yùn)行程序@RG是上面RG表示的內(nèi)容，后面是程序內(nèi)容像棘，這里的@GR內(nèi)容是可以自己在運(yùn)行程序是加入的

3稽亏，主體部分介紹

主體部分有11個(gè)主列和1個(gè)可選列

QNAME 比對(duì)的序列名稱 例如：M04650:84:000000000-B837R:1:1101:22699:1759（一條測序reads的名稱）

FLAG Bwise FLAG（表明比對(duì)類型：paring，strand缕题，mate strand等） 例如：99

RENAME 比對(duì)上的參考序列名 例如：NC_000075.6

POS 1-Based的比對(duì)上的最左邊的定位 例如：124057649

MAPQ 比對(duì)質(zhì)量 例如：60

CIGAR Extended CIGAR string（操作符：MIDNSHP）比對(duì)結(jié)果信息截歉；匹配堿基數(shù)，可變剪接等 例如：87M

MRNM 相匹配的另外一條序列烟零，比對(duì)上的參考序列名 例如：=

MPOS 1-Based leftmost Mate Position （相比于MRNM列來講意思和POS差不多） 例如：124057667

ISIZE 插入片段長度 例如：200

SEQ 和參考序列在同一個(gè)鏈上比對(duì)的序列（若比對(duì)結(jié)果在負(fù)義鏈上瘪松，則序列是其反向重復(fù)序列，反向互補(bǔ)序列） 例如：ATTACTTGGCTGCT

QUAL 比對(duì)序列的質(zhì)量（ASCII-33=Phred base quality）reads堿基質(zhì)量值 例如：-8CCCGFCCCF7@E-

可選的列 以TAG：TYPE：VALUE的形式提供額外的信息

4瓶摆，對(duì)于每一列內(nèi)容的詳細(xì)注解

（如果某一列為“0”或“*”表示這一列沒有信息）

第一列：QNAME

進(jìn)行reads比對(duì)時(shí)通常表示reads的名字凉逛，如果這條reads比對(duì)到多條序列或比對(duì)到這條序列的多個(gè)位置性宏，相同名字會(huì)出現(xiàn)多次群井。如果是pair-end reads，相同名字會(huì)出現(xiàn)2次毫胜，分別表示來自于R1文件的reads和R2文件的reads书斜，如果其matepair reads也比對(duì)2個(gè)位置，也會(huì)出現(xiàn)2次酵使，則相同名字共出現(xiàn)4次荐吉，如果一條reads也比對(duì)2個(gè)位置，則其matepair比對(duì)1個(gè)位置口渔，則共出現(xiàn)3次样屠，如果其matepair reads沒有比對(duì)上序列也會(huì)出現(xiàn)1次（第三列顯示“*”），所以pair-end測序，R1文件和R2文件同時(shí)mapping痪欲，相同reads的id最少出現(xiàn)2次悦穿。

第二列：FLAG

數(shù)值結(jié)果如下：

1（1）該read是成對(duì)的paired reads中的一個(gè)

2（10）paired reads中每個(gè)都正確比對(duì)到參考序列上

4（100）該read沒比對(duì)到參考序列上

8（1000）與該read成對(duì)的matepair read沒有比對(duì)到參考序列上

16（10000）該read其反向互補(bǔ)序列能夠比對(duì)到參考序列

32（100000）與該read成對(duì)的matepair read其反向互補(bǔ)序列能夠比對(duì)到參考序列

64（1000000）在paired reads中，該read是與參考序列比對(duì)的第一條

128（10000000）在paired reads中业踢，該read是與參考序列比對(duì)的第二條

256（100000000）該read是次優(yōu)的比對(duì)結(jié)果

512（1000000000）該read沒有通過質(zhì)量控制

1024（10000000000）由于PCR或測序錯(cuò)誤產(chǎn)生的重復(fù)reads

2048（100000000000）補(bǔ)充匹配的read

具體的flag值的解釋栗柒，可以參考samtools軟件提供的結(jié)果

samtools（Version: 1.3.1）

其中的samtools flags用法可提供flag值的查找結(jié)果

About: Convert between textual and numeric flag representation

Usage: samtools flags INT|STR[,...]

例如：

samtools flags 10

0xa 10 PROPER_PAIR,MUNMAP（10=2+8）

samtools flags 12

0xc 12 UNMAP,MUNMAP（12=4+8）

具體的flag值的解釋，也可參考如下網(wǎng)站：https://broadinstitute.github.io/picard/explain-flags.html

或者在必應(yīng)當(dāng)中搜索flag sam點(diǎn)擊Explain SAM Flags-GitHub Pages進(jìn)入該網(wǎng)頁知举，也可以輸入組合flag數(shù)值會(huì)出現(xiàn)所存在的意思

第三列：RNAME

表示read比對(duì)的那條序列的序列名稱（名稱與頭部的@SQ相對(duì)應(yīng)）瞬沦，如果這列是“*”，可以認(rèn)為這條read沒有比對(duì)上的序列雇锡，則這一行的第四逛钻，五，八遮糖，九 列是“0”绣的，第六，七列與該列是相同的表示方法

第四列：POS

表示read比對(duì)到RNAME這條序列的最左邊的位置欲账，如果該read能夠完全比對(duì)到這條序列（CIGAR string為M）則這個(gè)位置是read的第一個(gè)堿基比對(duì)的位置屡江，如果該read的反向互補(bǔ)序列比對(duì)到這條序列，則這個(gè)位置是read的反向互補(bǔ)序列的第一個(gè)堿基比對(duì)的位置赛不，所以無論該read是正向比對(duì)到該序列惩嘉，或是其反向互補(bǔ)序列比對(duì)到該序列，比對(duì)結(jié)果均是最左端的比對(duì)位置

第五列：MAPQ

表示為mapping的質(zhì)量值踢故，mapping Quality, It equals -10log10Pr{mapping position is wrong}, rounded to the nearest integer, A value 255 indicates that the mapping quality is not available. 該值的計(jì)算方法是mapping的錯(cuò)誤率的-10log10值文黎，之后四舍五入得到的整數(shù)，如果值為255表示mapping值是不可用的殿较，如果是unmapped read則MAPQ為0耸峭，一般在使用bwa mem或bwa aln（bwa 0.7.12-r1039版本）生成的sam文件，第五列為60表示mapping率最高淋纲，一般結(jié)果是這一列的數(shù)值是從0到60劳闹，且0和60這兩個(gè)數(shù)字出現(xiàn)次數(shù)最多

第六列：CIGAR

CIGAR string，可以理解為reads mapping到第三列序列的mapping狀態(tài)洽瞬，

對(duì)于mapping狀態(tài)可分為以下幾類：

M：alignment match (can be a sequence match or mismatch)

表示read可mapping到第三列的序列上本涕，則read的堿基序列與第三列的序列堿基相同，表示正常的mapping結(jié)果伙窃，M表示完全匹配菩颖，但是無論reads與序列的正確匹配或是錯(cuò)誤匹配該位置都顯示為M

I：insertion to the reference

表示read的堿基序列相對(duì)于第三列的RNAME序列，有堿基的插入

D：deletion from the reference

表示read的堿基序列相對(duì)于第三列的RNAME序列为障，有堿基的刪除

N：skipped region from the reference

表示可變剪接位置

P：padding (silent deletion from padded reference)

S：soft clipping (clipped sequences present in SEQ)

H：hard clipping (clipped sequences NOT present in SEQ)

clipped均表示一條read的序列被分開晦闰，之所以被分開放祟，是因?yàn)閞ead的一部分序列能匹配到第三列的RNAME序列上，而被分開的那部分不能匹配到RNAME序列上呻右。

"="表示正確匹配到序列上

"X"表示錯(cuò)誤匹配到序列上

而H只出現(xiàn)在一條read的前端或末端舞竿，但不會(huì)出現(xiàn)在中間，S一般會(huì)和H成對(duì)出現(xiàn)窿冯，當(dāng)有H出現(xiàn)時(shí)骗奖，一定會(huì)有一個(gè)與之對(duì)應(yīng)的S出現(xiàn)

例如：

162M89S

162H89M

149M102S

149H102M

40S211M

20M1D20M211H

S可以單獨(dú)出現(xiàn)，而H必須有與之對(duì)應(yīng)的S出現(xiàn)時(shí)才可能出現(xiàn)醒串，不可在相同第一列的情況下單獨(dú)出現(xiàn)

N：如果是mRNA-to-genome执桌，N出現(xiàn)的位置代表內(nèi)含子，其它比對(duì)形式出現(xiàn)N時(shí)則沒有具體解釋

M/I/S/=/X：這些數(shù)值的加和等于第10列SEQ的長度

第七列：MRNM

這條reads第二次比對(duì)的位置芜赌，在利用bwa mem產(chǎn)生sam文件時(shí)仰挣，如果該列是“”而

第3列RNAME不是“”則表示該reads比對(duì)到第3列顯示序列名的序列上，而沒有比對(duì)到其他位置缠沈，在利用bwa aln及bwa sampe比對(duì)生成的sam文件膘壶，如果和上述情況相同，則第7列為“=”洲愤，上述情況均表示該reads只比對(duì)到這一個(gè)位置

如果第3列RNAME和第7列MRNM都為“*”颓芭，則說明這條reads沒有匹配上的序列，如果這條reads匹配兩個(gè)序列柬赐，則第一個(gè)序列的名稱出現(xiàn)在第3列亡问，而第二個(gè)序列的名稱出現(xiàn)在第7列

第八列：MPOS

該列表示與該reads對(duì)應(yīng)的mate pair reads的比對(duì)位置，如果這對(duì)pair-end reads比對(duì)到同一條reference序列上肛宋，在sam文件中reads的id出現(xiàn)2次州藕，Read1比對(duì)的第4列等于Read2比對(duì)的第8列。同樣Read1比對(duì)的第8列等于Read2比對(duì)的第4列酝陈。例如：

第1列（Read id）····第4列（Read1比對(duì)位置）····第8列（mate-pair reads比對(duì)位置）

22699:1759····124057649····124057667

22699:1759····124057667····124057649

相同的reads id一個(gè)來自Read1文件床玻，一個(gè)來自Read2文件，第4列和第8列是對(duì)應(yīng)的

第九列：ISIZE

TLEN：signed observed Template LENgth （可以理解為文庫插入片段長度）

如果R1端的read和R2端的read能夠mapping到同一條Reference序列上（即第三列RNAME相同）沉帮，則該列的值表示第8列減去第4列加上第6列的值锈死，R1端和R2端相同id的reads其第九列值相同，但該值為一正一負(fù)遇西，R1文件的reads和R2文件的reads馅精，相同id的reads要相對(duì)來看严嗜。在進(jìn)行該第列值的計(jì)算時(shí)粱檀，如果取第6列的數(shù)值，一定要取出現(xiàn)M的值漫玄，S或H的值不能取茄蚯。

the unisgned observed template length equals the number of base from the leftmost mapped base to the rightmost mappedbase. Theleftmost segment has a plus sign and the rightmost has a minus sign

處理bam文件的主要生信軟件有

bwa压彭，bowtie2，samtools渗常，bedtools等

可以看mapping等多方面結(jié)果和統(tǒng)計(jì)壮不，bedtools工具中g(shù)enomeCoverageBed的功能是：Compute the coverage of a feature file among a genome

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