科學(xué)家在做細(xì)胞基因敲除之前會(huì)基因敲低翠桦，但由于shRNA技術(shù)本身的限制，無法得到基因功能完全缺失的細(xì)胞(一般shRNA約為70%敲除)，甚至經(jīng)常發(fā)生shRNA敲低了销凑，但細(xì)胞WB效果不好丛晌；同時(shí)Knockout也會(huì)出現(xiàn)使用碼移敲除導(dǎo)致敲除不干凈的問題！所以最后我們會(huì)選擇細(xì)胞基因敲除(大片段敲除)的方法斗幼，徹底敲除基因的蛋白質(zhì)功能澎蛛。如何才能高效敲除細(xì)胞基因的大片段？我們將在下面說明周期和方法：
1蜕窿、選擇性敲除基因位置谋逻、細(xì)胞敲除載體構(gòu)建：
我們選擇1-10kb的片段大小進(jìn)行敲除，這個(gè)效率比較合適桐经；一般選擇能非3倍數(shù)外顯子比較好毁兆。如果沒有，問題也不大阴挣，只能選擇大片段來做了气堕；
可以設(shè)計(jì)合成Dual-gRNA，通過PCR將目的gRNA構(gòu)建到敲除載體中畔咧，測(cè)序：
細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)染：
我們一般采用電轉(zhuǎn)構(gòu)建敲除細(xì)胞系
A茎芭、脂質(zhì)體參考各公司說明書；
B誓沸、如果用電轉(zhuǎn)梅桩，效率會(huì)高1倍；
使用我們專有的VIRUS-Free技術(shù)蔽介，其效率與使用病毒的效率相當(dāng)(但周期縮短了一半)摘投。
電轉(zhuǎn)后煮寡，經(jīng)過3天的藥物篩選虹蓄，可以制造單克隆：
A幸撕、單克隆環(huán)法：此類方法其優(yōu)點(diǎn)在于工作量小薇组，只需將轉(zhuǎn)染或者病毒載體感染后的細(xì)胞按照一定的細(xì)胞密度轉(zhuǎn)移至新皿中，并使用合適的藥物進(jìn)行篩選坐儿，最后在克隆環(huán)的幫助下對(duì)單克隆細(xì)胞株進(jìn)行挑選律胀，并在新皿中完成擴(kuò)增。缺點(diǎn)在于需要對(duì)細(xì)胞密度和藥物濃度繪制致死曲線并選取合適的細(xì)胞密度和藥物濃度進(jìn)行篩選貌矿，一些細(xì)小的密度和濃度差別都會(huì)導(dǎo)致難以獲取均一的單克隆炭菌，結(jié)果導(dǎo)致獲取的克隆不純，含有非整合的細(xì)胞逛漫。穩(wěn)定整合的細(xì)胞在這樣一類混合細(xì)胞中黑低，很快會(huì)失去生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，最終導(dǎo)致失去穩(wěn)定株。
B克握、ClonePlus技術(shù)：是我們研發(fā)的專用高效細(xì)胞敲除技能蕾管，主要經(jīng)過高通量電轉(zhuǎn)體系和高通量的克隆分選技能結(jié)合，獲得基因修改的單細(xì)胞菩暗，其克隆構(gòu)成率能夠達(dá)98%掰曾，就算是克隆構(gòu)成率低的細(xì)胞株也能獲得敲除單克隆⊥Ｍ牛【7-10天能夠完結(jié)絕大部分的細(xì)胞的單克隆工作】
PCR判定與擴(kuò)增：
將獲得的單克隆在96孔中傳代旷坦，并將細(xì)胞進(jìn)行PCR判定，由于我們使用大片段敲除佑稠，能夠直接進(jìn)行PCR判定塞蹭，無需雜亂的測(cè)序和讀圖判定過程；所以一般2天完成判定過程讶坯，然后就能夠?qū)⒖寺〖?xì)胞直接進(jìn)行直接擴(kuò)增番电，交給后面做RT-PCR檢測(cè)，保證其mRNA的完全敲除辆琅。
ClonePlus技術(shù)是整個(gè)敲除能加速的核心漱办，能加快懸浮細(xì)胞的擴(kuò)增周期：K562，THP-1等均適合婉烟。下圖是ClonePlus技術(shù)測(cè)驗(yàn)過腫瘤細(xì)胞的類型供各位參閱：
