ATAC-Seq Protocol for Buck Cell

ATAC-Seq Protocol for Buck Cell
版權說明：(XMU_Zhang_Lab, V-2019-03-23, 特別致謝：劉俊佳 /邊成林同學）

參考資料：
- 基本原理
- 其他實驗室的 P
材料準備
- 1. 轉座酶試劑:TruePrepTM DNALibrary Prep Kit V2 for Illumina?（Vazyme TD501/TD502/503）
  - TD501->>500 ng DNA, ATAC, 3000-30000 cells
  - TD502: -> 50 ng DNA, 20-> 2000 cells
  - TD503: -> 5 ng DNA
- 2 .建庫接頭
  - 單端96種接頭：TruePrepTM Index Kit V4 for Illumina? (VazymeTD204/TD205/TD206/TD207)
  - 雙端96種接頭：TruePrepTM Index Kit V2 for Illumina? (Vazyme TD202)
  - 雙端384種接頭：TruePrepTM Index Kit V3 for Illumina?(Vazyme TD203)
- 3. 磁珠: VAHTS DNA CleanBeads(Vazyme N411)
- 4. 其他: 臺盼藍析苫、PCR儀踪宠、離心機鄙信、磁力架陵吸、低吸附EP管、PCR管、無水乙醇逻杖、Qubit 試劑
- 5. 裂解液
  - 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2慨默，0.1% NP-40
  - 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2，0.1% NP-40, 0.02% digitonin （效果更好）
  - （不同的細胞適用的去污劑的類型和濃度有所差異弧腥，較強的裂解液會影響調控區(qū)域的打開
  - 與關閉，裂解強度不夠則影響細胞破裂潮太，影響酶進入到細胞核內管搪，實驗前需摸索最適裂解液濃度。）
- 6. Library QC primers and PCR reagent
  - Primers:
    - GAPDH CATCTCAGTCGTTCCCAAAGT TTCCCAGGACTGGACTGT
    - Gene desert1 AACTGGCTAGTAAGGAGTGAATG GGAAAGTCCCTCTCTCTAACCT
    - B2M GGGAATGGAAAGAAGTCCACTAT GCGACGCCTCCACTTATATT
    - Gene desert2 CCCAAACTCTGAGAGGCTTATT GAGCCATCATCTAGACACCTTC
  - Q5 based qPCR reagents: Q5 hostart enzyme (NEB), Sybgreen/Evagreen real-time pcr Dye( Invitrogen)
步驟：
- 1. 細胞收集
  - 1铡买、500×g更鲁，4℃離心5 min 收集細胞，棄上清奇钞，PBS 將細胞沉淀重懸澡为。
  - 2、血球計數(shù)板計數(shù)景埃。細胞活性可用0.4%臺盼藍染色鑒定媒至。（活率要在90%以上）
  - 3、取含有30000個單細胞的懸液谷徙，500×g拒啰，4℃離心5 min 收集細胞，棄上清完慧。
  - 4谋旦、棄上清，用 50μl 預冷的Lysis buffer 重懸細胞屈尼，冰上放置10 min 裂解細胞册着。
  - 5、在4℃下脾歧，500×g 離心5 min 收集細胞核甲捏。棄上清，置于冰上涨椒。
  - （在細胞聚集的管壁方向做好標記摊鸡，吸取上清時，在沉淀對立面輕輕吸取液體）蚕冬。
- 2. 轉座酶打斷
  - 組份 TD502
  - 1).在PCR管中配制如下打斷Mix：
    - 5×TTBL 4 μl
    - TTEMix V50 5 μl
    - ddH2O 11 μl
    - 總體積 20 μl
  - 1. 輕輕吹打混勻免猾，短暫離心。
  - 1. 將反應管置于PCR儀中囤热，進行如下反應：
    - 溫度時間
    - 37℃ 30min
    - 4℃ Hold
- 3.片段化產(chǎn)物純化
  - 1. 將 VAHTS DNA Clean Beads 從4℃取出猎提，室溫放置30 min，使用前渦旋混勻，再用2×的磁珠純化酶切產(chǎn)物锨苏，用TD502疙教，加40 μl磁珠到反應體系，吹打10次（磁珠與體系充分混合均勻）伞租。
  - （注：磁珠比較粘稠贞谓，用移液槍確保取到足夠的體積并緩慢打出。）
  - 2.室溫孵育5 min葵诈。
  - 1. 將反應管短暫離心并置于磁力架上分離磁珠和液體裸弦。
  - 1. 保持PCR管在磁力架上，待溶液澄清（約5 min）作喘，小心棄去上清理疙，不要擾到磁珠。
  - 1. 保持PCR管在磁力架上泞坦，加入200 μl新鮮配制的80%乙醇窖贤，注意加入乙醇時不要擾動磁珠，孵育30 sec后小心移除上清贰锁。
  - 1. 重復步驟5赃梧，總共漂洗兩次，輕輕離心李根，用白色小槍頭吸干乙醇槽奕。
  - 1. 開蓋干燥2.5 min左右。（磁珠剛好晾干房轿，表面無光澤即可粤攒，不要讓磁珠干裂）
  - 1. 磁珠晾干后，將 PCR 管從磁力架上取出囱持，加入 26μl 雙蒸水到PCR管中覆蓋磁珠夯接，吹打混勻磁珠。
  - 1. 室溫孵育2 min纷妆。
  - 1. 將 PCR 管短暫離心收集置于磁力架中分離磁珠和液體盔几，直到溶液澄清（約5 min）。
  - 1. 小心吸取24μl上清轉移到新的EP管中掩幢。
- 1. PCR富集
  - 1. 在RNA RNase Free的 PCR 管中配制以下組分：
    - [圖片上傳失敗...(image-2531fa-1561461961488)]
    - 注：若購買 TruePrepTM Index Kit V2 for Illumina? (Vazyme #TD202)的引物逊拍，則對應的 P5 Primer X 為 N501，P7 Primer X對應為 N7XX（對應每個樣品記住序號）际邻。
  - 2芯丧、使用移液器輕輕吹打混勻，在PCR儀中進行如下反應：
    - [圖片上傳失敗...(image-12645f-1561461961488)]
- 5. PCR 產(chǎn)物純化
  - 1. ```
      渦旋 VAHTS DNA Clean Beads 使其充分混勻世曾，加 60μl（1.2 x）VAHTS DNA Clean Beads 到上述PCR反應體系中（吹吸混勻10次保證整個體系均勻）缨恒。
```
- （注：磁珠比較粘稠，用移液槍確保取到足夠的體積并緩慢打出。）
- 1. ```
    室溫孵育5 min骗露。
```
  - 1. ```
      將反應管短暫離心并置于磁力架上分離磁珠和液體岭佳。
```
- 1. ```
    保持PCR管在磁力架上，待溶液澄清（約5 min）萧锉，棄去上清珊随，注意不要擾到磁珠。
```
  - 1. ```
      保持PCR管在磁力架上柿隙，加入200μl 新鮮配制的80%乙醇玫恳，注意加入乙醇時不要擾動磁珠， 孵育30 sec后小心移除上清优俘。
```
- 1. ```
    重復步驟5，總共漂洗兩次掀序。
```
  - 1. ```
      開蓋干燥2.5 min左右帆焕。（磁珠剛好晾干，表面無光澤即可不恭。不要讓磁珠干裂）
```
- 1. ```
    磁珠晾干后叶雹，將PCR管從磁力架上取出，加入22 μl雙蒸水覆蓋磁珠换吧，吹打混勻磁珠折晦。
```
  - 1. ```
      室溫孵育2min。（如果磁珠干燥開裂沾瓦，適當延長孵育時間满着。）
```
- 1. 將PCR管短暫離心收集置于磁力架中分離磁珠和液體。直到溶液澄清（約5 min）贯莺。
- 1. 小心吸取20μl 上清轉移到新的EP管中风喇，-20℃保存。
- 6. 長度分選 (可選步驟缕探， 0.55×/1×的方案進行分選) (200~700bp)
  - 使用VAHTSTM DNA Clean Beads對擴增產(chǎn)物進行長度分選魂莫，使用前請將磁珠平衡至室溫并渦旋振蕩充分混勻。
  - ▲初始PCR產(chǎn)物體積為50 μl爹耗，因PCR過程中樣品蒸發(fā)導致產(chǎn)物體積不足50 μl耙考。進行分選操作前必須使用滅菌蒸餾水將體積補齊至50 μl，否則分選片段的長度可能與預期不一致潭兽。
  - 1. 渦旋振蕩混勻VAHTS DNA Clean Beads并吸取27.5μl體積至50 μl PCR產(chǎn)物中倦始，吹打10次充分混勻，室溫孵育5 min讼溺。
  - （磁珠比較粘稠楣号，請準確移取相應的體積，否則可能導致分選片段的長度與預期不一致。）
  - 1. 將反應管短暫離心并置于磁力架上炫狱，使磁珠與液體分離藻懒，待溶液澄清后(約5 min)小心轉移上清至新的滅菌PCR管中，丟棄磁珠视译。
  - 1. 渦旋振蕩混勻VAHTS DNA Clean Beads并吸取50μl體積至上清中嬉荆，吹打10次充分混勻，室溫孵育5 min酷含。
  - 1. 將反應管短暫離心并置于磁力架上鄙早，使磁珠與液體分離，待溶液澄清后(約5 min)小心移除上清椅亚。
  - 1. 保持反應管始終處于磁力架上限番，加入200μl新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠。室溫孵育30 sec呀舔，小心移除上清弥虐。
  - 1. 重復步驟5，總計漂洗兩次媚赖。
  - 1. 保持反應管始終處于磁力架上霜瘪，開蓋空氣干燥磁珠約5 min。
  - 1. 將反應管從磁力架上取出惧磺，加入22μl滅菌超純水洗脫颖对。吹打10次充分混勻，室溫孵育5 min磨隘。
  - 1. 將反應管短暫離心并置于磁力架上缤底，使磁珠與液體分離，待溶液澄清后(約5 min)小心吸取20μl上清至新PCR管中番捂，-20°C保存训堆。
  - (此外，如需獲得長度分布更集中的文庫白嘁，擴增產(chǎn)物可使用膠回收試劑盒進行片段長度分選和純化坑鱼。如對文庫長度分布范圍無特殊要求，擴增產(chǎn)物也可不進行長度分選直接使用磁珠或柱純化試劑盒進行純化絮缅。
- 7. ATAC library QC:
  - A. Qubit定量:
    - 1. 按照如下體系配制溶液：
      - Qubit dsDNA HS assay各試劑加樣量：
      - [圖片上傳失敗...(image-bffcae-1561461961487)]
    - 1. 所有配制溶液進行渦旋震蕩3 s鲁沥，室溫放置2 min。
    - 1. 按順序插入Qubit進行檢測耕魄，選擇QubitdsDNA HS進行測量画恰。
  - B. 熒光PCR定量（富集效果:GADPH/desert1>40 fold; B2M/deset2>20 fold）
    - 前期準備：
      - 按5倍進行梯度稀釋的建庫樣品作為模板（或者基因組織DNA做定量標準曲線）
      - 熒光PCR相關試劑
      - 全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)SLAN-96S
    - 使用引物信息如下:
      - 基因 | 正向引物 | 反向引物
      - GAPDH | CATCTCAGTCGTTCCCAAAGT | TTCCCAGGACTGGACTGT
      - Gene desert1 | AACTGGCTAGTAAGGAGTGAATG | GGAAAGTCCCTCTCTCTAACCT
      - B2M | GGGAATGGAAAGAAGTCCACTAT | GCGACGCCTCCACTTATATT
      - Gene desert2 | CCCAAACTCTGAGAGGCTTATT | GAGCCATCATCTAGACACCTTC