成脂誘導(dǎo)
間充質(zhì)干細(xì)胞具有分化潛能拼坎，在成脂誘導(dǎo)過程中写妥，MSC會(huì)先分化成脂肪前體細(xì)胞鸳粉，在誘導(dǎo)因子的刺激下最終分化為脂肪細(xì)胞捌蚊，產(chǎn)生脂滴集畅。脂肪滴經(jīng)油紅O染色后在顯微鏡下呈現(xiàn)顯著的紅色，未分化細(xì)胞則無明顯顏色缅糟。
實(shí)驗(yàn)前期準(zhǔn)備
1. 細(xì)胞狀態(tài)：細(xì)胞增殖正常挺智，形態(tài)正常，干細(xì)胞代次越靠前越好窗宦，3代左右進(jìn)行誘導(dǎo)赦颇，但也不能太早，避免剛提取的干細(xì)胞中有雜細(xì)胞的存在赴涵。
2. 接種密度：細(xì)胞在80%左右進(jìn)行傳代媒怯，以3×10^4cells/c㎡接種，90-100%匯合度進(jìn)行誘導(dǎo)髓窜。
3. 包被：0.1%明膠包被扇苞。
4. 試劑：4℃冰箱溶解和保存試劑。
配制時(shí)注意：部分試劑是醇溶寄纵，注意開蓋時(shí)間鳖敷，避免試劑揮發(fā)；試劑可分裝擂啥，但不可以反復(fù)凍融哄陶。
成脂誘導(dǎo)步驟
1. 培養(yǎng)容器包被：0.1%明膠在培養(yǎng)箱中孵育30分鐘。
成脂誘導(dǎo)過程對(duì)細(xì)胞刺激比較大哺壶，細(xì)胞容易飄屋吨，除了明膠，還可以用多聚賴氨酸或者血清進(jìn)行包被山宾。
2. 接種誘導(dǎo)細(xì)胞：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞至扰，按照3×10^4cells/c㎡的細(xì)胞密度接種至包被后的培養(yǎng)器皿中，于37℃资锰，5%CO?培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)至匯合度90-100%敢课，棄掉上清，加入入成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)液（以下簡(jiǎn)稱“誘導(dǎo)液”）。
正常組：加入完全培養(yǎng)基直秆，誘導(dǎo)組：成脂誘導(dǎo)液濒募。
如果細(xì)胞增殖很快，誘導(dǎo)起始密度就不要太密圾结。
3. 細(xì)胞分化誘導(dǎo)：于37℃瑰剃，5%?CO?培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)約3天，更換為成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基維持液（以下簡(jiǎn)稱“”維持液）筝野，培養(yǎng)1天后晌姚，再更換為誘導(dǎo)液，繼續(xù)培養(yǎng)3天歇竟。
按照以上換液頻率誘導(dǎo)14-21天挥唠，并注意觀察細(xì)胞形態(tài)變化。根據(jù)細(xì)胞誘導(dǎo)形成的脂滴數(shù)量和大小焕议，決定終止細(xì)胞誘導(dǎo)的時(shí)間宝磨，并進(jìn)行染色鑒定。
換液方式為全換盅安；
誘導(dǎo)后期會(huì)看到細(xì)胞體積明顯增大懊烤，內(nèi)部有許多脂滴，此時(shí)應(yīng)該結(jié)束誘導(dǎo)宽堆，避免脂滴匯合，由于沒有支持的介質(zhì)茸习，脂滴會(huì)往上飄畜隶，細(xì)胞發(fā)生破裂。
4. 細(xì)胞固定：吸去培養(yǎng)基,使用適量1×PBS清洗一次号胚，棄去后取適量4%中性甲醛溶液覆蓋培養(yǎng)器皿底面籽慢，室溫固定30-60min，棄去固定液再使用1×PBS清洗兩次猫胁。
5. 油紅O染色：
油紅O工作液配制：取生理鹽水或1×PBS與油紅O原液配制油紅O工作液（油紅O原液: 生理鹽水=3:2）箱亿，現(xiàn)用現(xiàn)配。
配制后對(duì)油紅O工作液進(jìn)行離心或者過濾弃秆，除去染液中的過飽和析出物届惋。
染色：向清洗干凈的誘導(dǎo)孔內(nèi)加入適量工作液，靜置染色30min菠赚；吸走油紅O工作液脑豹，用1×PBS清洗兩次，并加入適量1×PBS避免細(xì)胞干燥衡查。
6. 誘導(dǎo)評(píng)估：顯微鏡下觀察成脂染色效果瘩欺，并進(jìn)行圖像采集和誘導(dǎo)評(píng)估；誘導(dǎo)成功時(shí)，脂滴會(huì)與油紅O染料結(jié)合后呈現(xiàn)紅色或橘紅色俱饿。
一般在整個(gè)視野下歌粥，有30%的脂滴存在就是比較優(yōu)秀的誘導(dǎo)結(jié)果了。
誘導(dǎo)過程注意要點(diǎn)
1. 培養(yǎng)基預(yù)熱：培養(yǎng)基可分裝拍埠，37℃水浴鍋預(yù)熱失驶，預(yù)熱的培養(yǎng)基貼壁加入孔板。
2. 分板接種：不確定誘導(dǎo)時(shí)間需要分板接種械拍，通常用6/12孔板突勇。
3. 調(diào)整時(shí)間：
（1）誘導(dǎo)液刺激脂滴形成，會(huì)損傷細(xì)胞坷虑，維持液維持脂滴甲馋，并促進(jìn)脂滴融合，恢復(fù)細(xì)胞狀態(tài)迄损。當(dāng)有小脂滴出現(xiàn)定躏，可以換成維持液維持。
（2）誘導(dǎo)過程中芹敌，3天誘導(dǎo)液+1天維持液循環(huán)痊远，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)，可以調(diào)整為2天誘導(dǎo)液+1天維持液氏捞，若細(xì)胞狀態(tài)不樂觀碧聪，先用維持液維持。如果細(xì)胞狀態(tài)非常差液茎，可以直接換回普通完全培養(yǎng)基逞姿，待細(xì)胞狀態(tài)恢復(fù)后繼續(xù)誘導(dǎo)。
（3）盡量每天觀察細(xì)胞狀態(tài)捆等，如果遇到周末不方便觀察滞造，可以在周五調(diào)整為維持液，周一換回誘導(dǎo)液栋烤，避免誘導(dǎo)液誘導(dǎo)超過3天谒养。
4. 染色固定和拍照：
（1）固定液恢復(fù)至常溫后固定細(xì)胞，輕柔加液明郭，避免卷邊买窟。
（2）油紅O是飽和溶液，不穩(wěn)定达址，需要配制為工作液蔑祟，再過濾。
（3）染色后盡快拍照沉唠，避免脂滴融合疆虚。
（4）拍照時(shí)需要留一點(diǎn)pbs浸泡，避免細(xì)胞干燥影響拍照。
常 見 問 題
1. 細(xì)胞狀態(tài)差
（1）細(xì)胞聚團(tuán)：控制細(xì)胞匯合度径簿、明膠包被罢屈。
（2）細(xì)胞空泡，細(xì)胞部分不貼壁篇亭，死亡：誘導(dǎo)前細(xì)胞狀態(tài)不佳缠捌，或誘導(dǎo)液刺激過大，需調(diào)整誘導(dǎo)時(shí)間译蒂。
2. 染色異常?
（1）染不上色：誘導(dǎo)時(shí)間不夠沒有脂滴曼月，脂滴少，誤判為脂滴柔昼，誘導(dǎo)過度
① 可能是誘導(dǎo)時(shí)間不夠：不同組織來源的MSC成脂效率不同哑芹，尤其是臍帶干細(xì)胞，誘導(dǎo)時(shí)間超過30天捕透，且脂滴不容易觀察聪姿。
②?或者存在雜細(xì)胞或細(xì)胞不正確：所用細(xì)胞為新鮮提取的細(xì)胞，可能有雜細(xì)胞的存在導(dǎo)致誘導(dǎo)不成功乙嘀。對(duì)于3t3-L1細(xì)胞成脂誘導(dǎo)末购，若細(xì)胞不正確，也誘導(dǎo)不成功虎谢。
③?將圓形膨大的細(xì)胞誤判為脂滴盟榴，沒有脂滴當(dāng)然染不上色。
④?誘導(dǎo)過度婴噩，脂滴漂浮隨換液丟失曹货。
（2）染色后呈現(xiàn)一整片紅色，可能是沒有清洗干凈讳推。需要再次清洗。
（3）染色后紅色在細(xì)胞表面：脂滴應(yīng)在細(xì)胞內(nèi)部玩般，表面的紅色不是脂滴银觅。
（4）未調(diào)整白平衡。
3. 雜質(zhì)：細(xì)胞代謝物坏为，油紅未過濾究驴，或者誘導(dǎo)過程中發(fā)生污染。?
