寫(xiě)在前面
前述啤贩，為了開(kāi)展基因組相關(guān)課題待秃，獲取準(zhǔn)確的基因結(jié)構(gòu)注釋信息，我舍棄了 IGV-GSAme痹屹，因?yàn)樗膶?shí)現(xiàn)不夠優(yōu)雅章郁。基于多次嘗試多次失敗的基因組瀏覽器開(kāi)發(fā)基因志衍，我最后還是選擇重新改造暖庄，并得到了 IGV-GSAman。這個(gè)軟件推出來(lái)后楼肪，不少朋友都挺感興趣培廓。事實(shí)上，這塊確實(shí)是剛需淹辞，主要場(chǎng)景有二：
- 基因組項(xiàng)目医舆，往往需要配套高質(zhì)量的基因結(jié)構(gòu)注釋，不然序列再準(zhǔn)確象缀，大伙也用不起來(lái)；
- 基因家族分析項(xiàng)目爷速，由于絕大多數(shù)基因組并無(wú)準(zhǔn)確的基因結(jié)構(gòu)注釋（擬南芥都有基因結(jié)構(gòu)注釋錯(cuò)誤央星，不談水稻，甚至其他更為復(fù)雜的基因組）惫东；我基本每天都會(huì)收到基因家族分析文稿的審稿莉给，看一下基因結(jié)構(gòu)圖就可以決定是否讓重做毙石。原因無(wú)他，基因家族分析的基礎(chǔ)是正確的序列颓遏。在錯(cuò)誤的基因組基因結(jié)構(gòu)注釋的背景下徐矩，沒(méi)有對(duì)每一個(gè)成員進(jìn)行準(zhǔn)確結(jié)構(gòu)矯正，其實(shí)論文從一開(kāi)始就錯(cuò)了叁幢，必然不適合發(fā)表滤灯。
那么如何做「基因結(jié)構(gòu)注釋矯正」？當(dāng)然是使用 IGV-GSAman曼玩。自然鳞骤，最好的證據(jù)是基因結(jié)構(gòu)得到 RNAseq 測(cè)序數(shù)據(jù)支持，尤其是外顯子邊界和UTR部分黍判。于是涉及到回帖豫尽，如此會(huì)有兩個(gè)新場(chǎng)景：
- 對(duì)整個(gè)物種全基因組進(jìn)行結(jié)構(gòu)注釋矯正，如此結(jié)果很好顷帖，一勞永逸美旧，但是工作量巨大，除非常年研究某一物種贬墩，否則不一定能投入足夠資源去完成陈症，即使有了 GSAman；
- 對(duì)物種感興趣的基因集合震糖，或者基因家族進(jìn)行結(jié)構(gòu)注釋矯正录肯，如此普遍適用于一般基因組課題，或者基因家族分析課題吊说，以及普通濕實(shí)驗(yàn)的特定基因功能研究課題论咏。
對(duì)于前者，往往實(shí)施人員有足夠的計(jì)算資源可以進(jìn)行大規(guī)模RNAseq讀段回貼颁井；但對(duì)于后者厅贪，則往往不然，許多時(shí)候雅宾，我們可能只有一臺(tái)內(nèi)存 4g ( 8g ) 的筆記本养涮，同時(shí)電腦的硬盤資源也不是很充裕。但是眉抬，我們就關(guān)注到幾個(gè)基因贯吓，那么如何對(duì)著這幾個(gè)基因進(jìn)行充分的基因結(jié)構(gòu)注釋矯正？如何利用 RNAseq 測(cè)序數(shù)據(jù)蜀变？
為此悄谐，我猶豫了許久，也加上最近有個(gè)可能的項(xiàng)目申請(qǐng)库北，幾個(gè)老師一起討論到爬舰，干脆就寫(xiě)出來(lái)们陆，方便大伙使用（PS：如果這個(gè)插件有遇到問(wèn)題，不要來(lái)問(wèn)我情屹，我挺忙的坪仇，直接去 TBtools技能易物群 即是）。命名為 Target Genome Region Mapping垃你。
功能簡(jiǎn)單介紹
Target Genome Region Mapping 可以正常在 Windows （已測(cè)試）和 MacOS（沒(méi)錢買設(shè)備椅文，未測(cè)試）下使用。功能簡(jiǎn)單蜡镶，基于用戶提供的基因組序列以及目標(biāo)基因組區(qū)間（一般為一些基因所在的染色體區(qū)間）雾袱，進(jìn)行有限制的 RNAseq 讀段回帖。做了一些邏輯優(yōu)化官还，所以整體表現(xiàn)跟進(jìn)行全基因組回帖類似芹橡。
可以看到，是上下兩個(gè) Track （上面是 Target Genome Region Mapping 的結(jié)果望伦，下面是全基因組作為參考輸入的結(jié)果）的 MisMatch Pattern 是完全一樣的林说，覆蓋度只差1個(gè)read（這個(gè)是IGV窗口scale的問(wèn)題，對(duì)基因結(jié)構(gòu)注釋矯正完全不影響）屯伞，這說(shuō)明不存在非特異性回帖腿箩。整體效果良好。具體放大這個(gè)區(qū)間來(lái)看
因?yàn)槭褂昧?Target Region 限制劣摇，所以在現(xiàn)在區(qū)間外的部分珠移，完全沒(méi)有讀段。那么好處是什么：
- 使用超低內(nèi)存末融，擬南芥钧惧，對(duì)130+個(gè)MYB進(jìn)行區(qū)間mapping，只需要用不到 5M內(nèi)存（注意勾习，是內(nèi)存）浓瞪；如果是對(duì)于一些超大基因組，比如辣椒 3G巧婶，實(shí)際編碼序列很少乾颁，那么完全可以在筆記本上進(jìn)行完成；
- 速度更快艺栈！因?yàn)橄拗屏嘶靥麉^(qū)間英岭，所以速度快得到。擬南芥的眼滤，30M RNAseq（大概20G的測(cè)序數(shù)據(jù)文件）巴席，跑下來(lái)只有 5min 左右一個(gè)樣品；如果是全基因組诅需，同等配置下漾唉，則需要跑一個(gè)多小時(shí)，更不談大型基因組堰塌；
- 真的很準(zhǔn)赵刑， idea 我想到的時(shí)候是興奮的， 不過(guò)設(shè)計(jì)半天场刑，發(fā)現(xiàn)類似的 idea 2020年有個(gè)大佬在他的軟件更新上寫(xiě)進(jìn)去了般此，anyway..... 還是有不少區(qū)別，從具體實(shí)現(xiàn)和最終目的牵现，盡管concept是類似的铐懊。
回到主題....
插件的安裝
直接在 TBtools 的插件商店獲取即可，
點(diǎn)擊安裝會(huì)跳轉(zhuǎn)到奶畔固郏快傳科乎，注意！文件夾中有一個(gè)是插件文件贼急，另一個(gè)壓縮包是示例數(shù)據(jù)茅茂，示例數(shù)據(jù)如不無(wú)需要，其實(shí)不用下載太抓。
插件文件下載好了空闲，直接從主界面 Others -> Plugins -> Install Plugin 安裝即可（目前完全開(kāi)放，不確定后面是不是會(huì)因?yàn)橛脩魡?wèn)題太多走敌，干脆不開(kāi)放）
至于使用
打開(kāi)插件碴倾，按照界面文本提示操作即可，
輸出文件是 SAM 格式（注意到掉丽，因?yàn)樽隽?Target Region Mapping跌榔，所以文件也很小，對(duì)硬盤大小要求也變低）机打，幾乎所有人都能干這事~
實(shí)際示例
按照界面提示矫户，設(shè)置參數(shù)即可，其線程數(shù)自己調(diào)整下残邀。輸出目錄最好自己創(chuàng)建一個(gè)皆辽。
支持批量輸入，比如有10個(gè)樣品的測(cè)序數(shù)據(jù)（雙端芥挣，一共20個(gè)文件）驱闷，可以一次丟入。速度還是比較快空免。
注意到其中輸入的是 AthMYB.bed 空另，信息如下
其實(shí)就是每個(gè)基因的染色體位置，因?yàn)榧傧肽繕?biāo)就是矯正這些基因結(jié)構(gòu)注釋信息蹋砚《蟛ぃ或者說(shuō)摄杂，具體查看。當(dāng)然循榆，其實(shí)如果你對(duì)其他區(qū)間析恢，想看看他在不同樣品里面到底有沒(méi)有表達(dá)，你有很多幾十個(gè)測(cè)序數(shù)據(jù)秧饮，想看看到底某個(gè)區(qū)間在那一套數(shù)據(jù)里面的測(cè)序深度最高映挂，邏輯上，也可以試試盗尸。至于其他使用柑船，大伙感興趣都可以試試。
等待幾分鐘（具體看CPU和硬盤IO泼各，抱歉鞍时，我發(fā)現(xiàn)我的新電腦，只花了2分鐘历恐，驚呆了）寸癌，可以在輸出目錄看到輸出文件。
對(duì)于這個(gè)文件弱贼，直接使用 TBtools 的 SAMtools GUI Wrapper 插件蒸苇，進(jìn)行排序即可（這個(gè)插件也在插件商店可以下載，也支持批量操作）吮旅。
排序結(jié)束溪烤，可以看到輸出文件
其中有了兩個(gè)文件就可以直接用 IGV 進(jìn)行可視化了。
縮小后
也可以直接導(dǎo)入 bed 為 Region of Interest庇勃，進(jìn)行超便捷多基因快速矯正
寫(xiě)在最后
路漫漫其修遠(yuǎn)兮~ 后來(lái)我仔細(xì)想想檬嘀，寫(xiě)的每一個(gè)軟件，每一個(gè)功能责嚷，似乎都是環(huán)環(huán)相扣鸳兽，緊密關(guān)聯(lián)。到底罕拂，還是期望能有更好用的工具揍异，可以輔助更多科研工作人員開(kāi)展工作，花更少的時(shí)間爆班，做更好的工作衷掷。
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