參考:
https://www.biomart.cn/experiment/228.htm
重組DNA技術(shù)可以用于：
（1）據(jù)需要選擇目的基因（DNA片段）在體外與基因運載體重組箍铲，轉(zhuǎn)移至另一細胞或生物體內(nèi)，以達到改良和創(chuàng)造新的物種和治療人類疾病的目的；
（2）是現(xiàn)代分子生物技術(shù)發(fā)展中最重要的成就之一檀何，即是基因工程(GeneEngineering)的核心技術(shù)重虑。
實驗方法原理
Adeasy系統(tǒng)利用了腺病毒具有的高感染能力践付，可高度濃縮等優(yōu)點，并破壞了腺病毒基因組中的早期基因E1缺厉，使之成為較為安全永高、高效的病毒載體。利用帶有 E1 基因的 293 細胞作為包裝細胞提针，通過倍比擴增命爬，富集病毒顆粒，并通過CsCl 梯度離心辐脖，透析進行分離純化饲宛。對絕大多數(shù)的細胞株可以達到近乎100％的感染效率。但需要指出的是 Adeasy 同樣具有所有病毒載體或轉(zhuǎn)染試劑都不可避免的細胞毒性問題嗜价。
一艇抠、目的基因的克隆（以pshuttle-CMV質(zhì)粒為例）
- 選擇適當酶切位點久锥，進行酶切連接家淤，將目的片段插入pshuttl-CMV質(zhì)粒多克隆位點。
- 重組質(zhì)粒鑒定： 酶切鑒定或測序瑟由。
- 重組質(zhì)粒擴增絮重，純化并準備適量含目的基因的穿梭質(zhì)粒。
- 用PmeI單酶切線性化重組穿梭質(zhì)粒歹苦，電泳鑒定質(zhì)粒完全被切開青伤。
- 膠回收線性化質(zhì)粒，以備共轉(zhuǎn)化使用殴瘦。
二狠角、共轉(zhuǎn)化
1 大腸桿菌BJ5183電轉(zhuǎn)感受態(tài)制備
- 從新鮮瓊脂板上挑取單個BJ5183細菌，接種于LB培養(yǎng)基中痴施，37℃振搖過夜擎厢。
- 接種25ml過夜培養(yǎng)物于500ml LB培養(yǎng)基，37℃振搖辣吃，至OD600 達到0.4动遭。
- 迅速將培養(yǎng)物置于冰浴中30min，至充分冷卻神得。
- 將菌液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管中厘惦，4℃下以2500r/min離心15 min，棄培養(yǎng)液，回收細胞宵蕉。
- 以10ml預(yù)冷的10%甘油洗滌沉淀酝静，低溫離心，共兩次羡玛。
- 加約1ml（適量）預(yù)冷的10%甘油重懸沉淀别智，稀釋懸液100倍，測量OD600稼稿，至稀釋濃度為2-3×1010個細胞/ ml （1.0 OD600約2.5×1010個細胞/ml）薄榛。分裝，-80℃或液氮保存待用让歼。
2 病毒骨架質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌敞恋，擴增，純化谋右。
3 將1-5μl （約1μg） 線性化的穿梭質(zhì)粒及1μl（約100ng/μl）病毒骨架質(zhì)粒（如pAdEasy-1）加入至含約40μl BJ5183電轉(zhuǎn)感受態(tài)的EP管中混勻硬猫，冰上冷卻。
4 將混合物加入電轉(zhuǎn)杯改执，電擊（1250-1500V/mm,5ms）啸蜜。
5 電擊結(jié)束取出樣品，加入1ml SOC或LB培養(yǎng)液天梧，37℃低速振蕩40min盔性。
6 取適當體積的電擊轉(zhuǎn)化細胞液涂于數(shù)個卡那霉素抗性平板（25-50mg/ml），37℃培養(yǎng)16-20hr呢岗。
7 次日挑取平板上長出的菌落（選擇最小的菌落），接種于3ml含25-50mg/ml的LB培養(yǎng)基蛹尝，37℃培養(yǎng)10-15hr后豫。
8 堿裂法提取質(zhì)粒，0.8%瓊脂糖凝膠電泳篩選突那，大質(zhì)粒為可能陽性克隆挫酿，進一步酶切鑒定。以PacI單酶切愕难，0.8%瓊脂糖凝膠電泳如顯示出一條大片段（約30kb）早龟，及一條小片段（約3.0或4.5kb）（同時可進行其它酶切鑒定），則基本確定為陽性克隆猫缭。
9 取1-5μl 陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌細胞（BJ5183為recA+,質(zhì)粒DNA易發(fā)生突變葱弟，DH5α或JM109，XL1-blue菌株為重組缺陷性菌株猜丹，可穩(wěn)定擴增已鑒定的重組質(zhì)粒）芝加，擴增細菌并純化質(zhì)粒。
三 重組病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)293細胞
293細胞培養(yǎng)：轉(zhuǎn)導(dǎo)24小時前射窒，以方瓶為例藏杖，接種2×106 293細胞于25cm2方瓶将塑，使生長密度約50-70%。（也可以使用6孔或96孔板）
以PacI單酶切重組病毒質(zhì)粒（轉(zhuǎn)導(dǎo)25cm2方瓶約需4μgDNA）蝌麸，完全線性化后点寥，乙醇沉淀，再以20 μl ddH2O溶解来吩。
脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒（以Lipofectamine為例）：每4μg PacI約需20μl Lipofectamine包裹开财。質(zhì)粒及脂質(zhì)體分別稀釋于500μl無血清培養(yǎng)基再混合，置于室溫下15-30min误褪。
以無血清培養(yǎng)基輕輕洗滌培養(yǎng)瓶责鳍，另加2.5ml無血清培養(yǎng)基，37℃放置10min兽间。
將Lipofectamine-DNA混合物加入培養(yǎng)瓶历葛，37℃孵箱放置4hr。
4hr后嘀略，棄Lipofectamine-DNA混合液恤溶，另加入6ml DMEM完全培養(yǎng)基（含10% FCS）。如有大量細胞漂浮帜羊，可不棄Lipofectamine-DNA液咒程，加入6ml DMEM完全培養(yǎng)基，37℃孵育過夜讼育，再換液帐姻。
培養(yǎng)過程中觀察細胞生長情況。約2周后可觀察到細胞病變（CPE）出現(xiàn)（如用pAdTrack-CMV質(zhì)粒奶段，由于含GFP饥瓷，可觀察到綠色熒光）。
四 重組病毒鑒定
轉(zhuǎn)導(dǎo)10-14d后痹籍，收集細胞沉淀呢铆，加入2ml滅菌的PBS混懸，凍融細胞蹲缠，離心后收集上清保存于-80℃棺克。
取30-50% 步驟1中上清，感染50-70%飽和度的25cm2方瓶中293細胞线定。2-3d后出現(xiàn)明顯細胞病變娜谊。
感染后3-5d,當1/3-1/2細胞漂浮時收集病毒。按步驟1收集細胞并準備病毒上清渔肩。通過Western blot和/或PCR鑒定重組腺病毒產(chǎn)生因俐。
PCR鑒定重組病毒。取5μl病毒上清加入10μl蛋白酶K，55℃孵育1hr抹剩，再煮沸5min撑帖，離心后取1-2μl作PCR。
五 重組病毒擴增澳眷，純化
75cm2方瓶中接種293細胞胡嘿，至密度達到90%，加入適量病毒上清感染細胞钳踊。3-4d后衷敌，細胞幾乎變圓，且有一半細胞漂浮拓瞪，則收集所有細胞缴罗。約500g轉(zhuǎn)速離心，棄上清祭埂。
以滅菌PBS重懸沉淀愧薛，反復(fù)凍融4次卡儒。4℃下7000g離心5min.病毒純化至少需要30瓶75cm2方瓶細胞胞皱。
CsCl連續(xù)梯度離心純化：50ml離心管中稱量4.4g CsCl赋元，加入8ml病毒裂解上清液，混勻泰演，體積約為10ml呻拌。轉(zhuǎn)移至12ml超速離心管（用于SW41轉(zhuǎn)頭）中，覆蓋約2ml礦物油睦焕。平衡后藐握，10℃下32000 rpm離心18-24hr，用注射器抽吸離心出的病毒帶复亏。
（也可CsCl不連續(xù)梯度離心：20ml超速離心管中緩慢加入8ml CsCl 1.4 （53 g + 87 mL 10 mM Tris-HCl趾娃，pH=7.9），上面小心加入6 mL CsCl 1.2 （26.8 g + 92 mL 10 mM Tris-HCl缔御，pH=7.9），再小心加入病毒上清液至體積達到20ml妇蛀。平衡后耕突，4℃下 23000rpm離心90min （SW28轉(zhuǎn)頭），用注射器抽吸下層藍白色病毒帶）
4 病毒透析去鹽：配置透析液（10 mM Tris pH 8.0, 2 mMMgCl2, 5% sucrose）评架，滅菌處理眷茁。4℃透析，更換3次透析液纵诞，可基本去除CsCl上祈，病毒保存于-80℃。
六 病毒滴度測定（TCID50）
細胞準備：96孔板中接種100μl 293細胞，每孔細胞數(shù)約104個登刺，以2% DMEM培養(yǎng)
稀釋病毒液準備：以2% DMEM將病毒液稀釋成8個較高濃度（如10-3-10-10）籽腕，每個濃度重復(fù)10個，每孔加入病毒稀釋液100μl纸俭。另留兩排不加病毒液作為陰性對照皇耗。37℃下，孵箱培養(yǎng)10天揍很。
10d后觀察細胞郎楼，記數(shù)每排出現(xiàn)CPE的孔數(shù)，計算細胞病變率窒悔。（如某一濃度各孔細胞全部病變呜袁，比率為1，如無細胞病變简珠，則比率為0）阶界。
計算T =10×101 + d （S - 0.5） /ml
d = Log 10 稀釋度（如為10倍稀釋℃，d=1）
S = 各濃℃細胞病變比率之和
實驗室重組腺病毒常用質(zhì)粒：
病毒骨架質(zhì)粒：pAdEasy-1, pAdEasy-2
穿梭質(zhì)粒：p-Shuttle, p-Shuttle-CMV, pAdTrack, pAdTrack-CMV
注意事項:
也可CsCl不連續(xù)梯度離心：20ml超速離心管中緩慢加入8ml CsCl 1.4 (53 g + 87 mL 10 mM Tris-HCl北救，pH=7.9)荐操，上面小心加入6 mL CsCl 1.2 (26.8 g + 92 mL 10 mM Tris-HCl，pH=7.9)珍策，再小心加入病毒上清液至體積達到20ml托启。平衡后，4℃下 23000rpm離心90min (SW28轉(zhuǎn)頭)攘宙，用注射器抽吸下層藍白色病毒帶屯耸。
其他
腺病毒是一長約 36kb 雙鏈、無包膜的 DNA 病毒蹭劈，具有易感染疗绣、易獲得、且能感染多種細胞等特點; 腺病毒不整合到染色體 DNA 中铺韧，因而不會帶來嚴重的副作用多矮，可用于體內(nèi)外基因治療、基因轉(zhuǎn)導(dǎo)等研究哈打。
