來源： 三維基因組Magic [三維基因組Magic](javascript:void(0);) 2017-11-29
Hi-C文庫數(shù)據(jù)質(zhì)控及解讀
數(shù)據(jù)自身的質(zhì)量在很大程度上決定了分析結(jié)果的準(zhǔn)確和可靠，隨著Hi-C技術(shù)在三維基因組學(xué)上的快速推廣，對于Hi-C數(shù)據(jù)本身的質(zhì)量和測序深度也逐漸引起研究人員的重視。同時對該技術(shù)的進一步優(yōu)化和改進使之能夠在更少的細(xì)胞起始量及測序量達到更高分辨率也成為了一個技術(shù)發(fā)展新的熱點规哲。本文旨在對Hi-C及相關(guān)技術(shù)的發(fā)展進行簡略地介紹，并對Hi-C數(shù)據(jù)展示的無效數(shù)據(jù)進行分析庐氮，以期能讓讀者能更清晰地理解無效數(shù)據(jù)的組成膘茎，在后續(xù)的實驗過程中能更好地改進實驗方法，獲得一份可靠的Hi-C的數(shù)據(jù)脚草。
2009年Erez Lieberman-Aiden在3C的基礎(chǔ)上赫悄，獨創(chuàng)地在粘性末端添加了生物素，使得嵌合片段能被鏈親和素特異性富集馏慨，發(fā)明了第一代 dilution HiC技術(shù)1）埂淮。Hi-C的發(fā)明與二代測序完美結(jié)合，解決了5C在全基因組水平構(gòu)象數(shù)據(jù)量瓶頸的問題熏纯，使得在全局范圍內(nèi)研究三維結(jié)構(gòu)成為可能同诫。
圖1.Hi-C實驗原理
早期的實驗方案認(rèn)為，去垢劑SDS在對交聯(lián)的細(xì)胞核進行處理時樟澜，即使是低濃度的SDS（0.3%-1%SDS）在加熱到65℃時误窖，會導(dǎo)致細(xì)胞核碎裂，基因組的DNA會釋放到溶液中秩贰，因此第一版本的Hi-C霹俺，在酶連反應(yīng)體系下，選用了近8ml的大連接體系毒费。后來丙唧，4C研發(fā)人員通過用顯微鏡觀測SDS處理細(xì)胞核，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核仍然維持在一個較為穩(wěn)定的核結(jié)構(gòu)觅玻。在共聚焦顯微鏡下觀察想际，1%SDS處理細(xì)胞核，會導(dǎo)致細(xì)胞核的通透性發(fā)生改變溪厘，但很少細(xì)胞核發(fā)生裂解胡本。
另一個影響交聯(lián)反應(yīng)的因素是溫度，通常認(rèn)為65℃以上畸悬，在有NaCl存在的情況下侧甫，甲醛交聯(lián)的DNA會發(fā)生解交聯(lián)現(xiàn)象，從而影響染色質(zhì)構(gòu)象的穩(wěn)定蹋宦。
在第一版本的Hi-C選用了65℃ 1%SDS處理細(xì)胞核10min披粟，從最終的數(shù)據(jù)看染色質(zhì)間的互作數(shù)據(jù)高達27.1%-65.3%。通常認(rèn)為染色質(zhì)是獨立折疊定位在細(xì)胞核中形成染色質(zhì)領(lǐng)域的冷冗，因此染色質(zhì)間的數(shù)據(jù)通常會認(rèn)為是無效數(shù)據(jù)（bais）守屉。
直到2012年Chen Lin實驗室意識到細(xì)胞核的擾動會影響到染色質(zhì)的高級構(gòu)象，因此他們在Hi-C實驗的基礎(chǔ)上贾惦，將生物素標(biāo)記在蛋白上胸梆，將反應(yīng)體系固定在磁珠上敦捧，使得反應(yīng)體系擾動更小，更穩(wěn)定碰镜，TCC2）獲得的數(shù)據(jù)結(jié)果表明該方法可以顯著降低染色質(zhì)間的數(shù)據(jù)占比例valid pairs的比例兢卵。
圖2.TCC實驗原理
2014年EreZ對Hi-C的實驗進行了進一步的改進3），他們在SDS處理細(xì)胞核的步驟選用了更溫和的0.5%SDS 62℃處理5-10min绪颖，而細(xì)胞連接的體系也降低到1ml秽荤，值得一提的是他們在文章中嘗試了未交聯(lián)的HiC實驗。發(fā)現(xiàn)除了噪音增加外柠横，得到了與正常HiC類似的熱圖窃款。
In situ Hi-C的改進使得染色質(zhì)間的互作數(shù)據(jù)進一步降低，實測數(shù)據(jù)顯示Trans-interaction其占valid pair的比例在20%左右牍氛。
在2015年晨继，又有研究將SDS的處理條件更換成37℃ 60min，他們認(rèn)為該方法可以更大程度維持細(xì)胞核的穩(wěn)定性搬俊，提高intra/inter數(shù)據(jù)的比例4）紊扬。
表1：in solution Hi-C與 in nucleus Hi-C數(shù)據(jù)比較
隨著對HiC數(shù)據(jù)的進一步認(rèn)識，研究人員發(fā)現(xiàn)一些超近距離的連接（<20Kb的數(shù)據(jù)）可能并不是有意義的由蛋白介導(dǎo)的空間上靠近的互作唉擂，而可能就是線性距離較近而引起的隨機連接餐屎，因此引入了這一參數(shù)來評判數(shù)據(jù)的質(zhì)量。
為了更好地去除隨機連接導(dǎo)致的bais玩祟，有研究利用統(tǒng)計模型認(rèn)為三片段的連接可減少隨機連接的可能性腹缩，因此他們采用了類似于ChIA-PET
的方法，在連接反應(yīng)過程中空扎，添加一個帶有生物素的bridge-linker5）藏鹊，通過富集帶有l(wèi)inker的嵌合片段，來改善實驗中存在的隨機連接可能性转锈。作者自測的結(jié)果表明伙判，添加linker后染色質(zhì)內(nèi)的互作比例比in situ Hi-C和HiChIP都有顯著改善。
圖3.BL-HiC實驗原理圖
除了cis/tran作為評判Hi-C數(shù)據(jù)的質(zhì)量以外黑忱，Hi-C數(shù)據(jù)中還存在大量的無效數(shù)據(jù)，它們的存在會影響數(shù)據(jù)的有效利用率勒魔，以下篇幅將逐一進行介紹甫煞。
為了更好地理解Hi-C數(shù)據(jù)，在此我們簡要介紹下基于illumina平臺的二代測序文庫冠绢。
圖4.二代測序文庫建庫示意圖
在標(biāo)準(zhǔn)的二代文庫中抚吠，DNA片段通過末端補平加A；再添加adapters 弟胀；此時reads的兩側(cè)各帶發(fā)卡結(jié)構(gòu)P5/P7的測序接頭楷力；為了獲取足夠上機的DNA文庫喊式，通常還需要進行一輪擴增；擴增后的文庫兩端各帶一種測序接頭萧朝。
圖5.橋式PCR
在pool DNA到芯片上時岔留，文庫片段首先anneal在芯片的測序接頭上；然后用DNA聚合酶進行擴增检柬，DNA生長在芯片上献联；經(jīng)過25-28輪的擴增，每條reads被擴增至數(shù)以千計的拷貝何址，此時就可以利用添加可逆的終止子來檢測堿基的組成里逆。通過150輪添加可逆終止子并采集信號即可完成測序。
由于DNA聚合酶的自身的偏性用爪，GC含量相對合適的片段及小片段更容易在芯片生長階段得到富集原押。小片段（<150nt）在測序過程中，由于兩端各讀取150個堿基偎血，就極可能將DNA插入片段讀通诸衔，從而這部分的DNA就可能被檢測到adapter污染。
圖6.測序read示意圖
Hi-C標(biāo)準(zhǔn)文庫是標(biāo)準(zhǔn)的Chimera結(jié)構(gòu)烁巫，在將兩端序列進行比對到基因組上時署隘，理論上兩側(cè)pair ends可以分別比對到基因組的兩個座位。由于DNA在碎片化過程中亚隙，剪切是隨機的磁餐，因此酶切位點末端補平形成的junction fragment很可能分布在一側(cè)的reads中，常規(guī)的比對分析是很難處理chimera的阿弃。在HiC-Pro6）和HiCUP7）軟件中诊霹，他們會去識別理論的junction fragment。如HiC-Pro在比對時先進行Global Mapping渣淳，后將unmapping的reads用junction fragment序列進行識別并切割脾还，再進行l(wèi)ocal mapping，最終將數(shù)據(jù)進行合并入愧。
圖7.HiC-Pro的兩種比對策略
在實際比對中即使采用兩步比對方式鄙漏，仍有可能是只有一端序列能比對到基因組中，另外一端無法識別到基因組中棺蛛，這種情況我們將其歸類為Singleton怔蚌。它產(chǎn)生的原因可能有①adapter污染（先前數(shù)據(jù)沒進行過濾）；②另一側(cè)數(shù)據(jù)質(zhì)量較差旁赊，多數(shù)為N的區(qū)域桦踊；③DNA片段被降解或酶切反應(yīng)產(chǎn)生星號活性履怯。同時片段過短驼修，150堿基已經(jīng)讀通了生物素標(biāo)記的位點砸捏，但是該位點不是正常的junction fragment景殷。在植物樣本中，singleton較為常見杖狼，可能與細(xì)胞壁破碎不完全炼蛤，部分細(xì)胞質(zhì)成分進入到反應(yīng)體系影響酶切有關(guān)。
有些植物的基因組存在大量的重復(fù)序列本刽，如玉米中85%的序列被認(rèn)為是重復(fù)序列鲸湃。這對要求兩端都要唯一比對的HiC而言是巨大的挑戰(zhàn)，一旦有一段比對到兩個或兩個以上的位點子寓，該reads就將被歸類到Multiple mapped reads中暗挑。
如果在比對過程中，global mapping 和 local mapping均無法將序列識別到特定的位點斜友，這種序列會被歸類到Unmapped reads炸裆。它可能產(chǎn)生的原因是基因組的組裝完整度較差，基因組中存在大量的gap無法識別鲜屏，被填充為NNNNN烹看。另一個原因是酶切片段較碎，多個酶切片段連接在一起洛史，無法識別到特定座位惯殊。
如果兩側(cè)數(shù)據(jù)都能比對到基因組的數(shù)據(jù)會被統(tǒng)一認(rèn)為是Unique mapped reads，此時對于動物基因組也殖，unique mapped reads 占測序量（clean reads）50%以上應(yīng)是可接受的范圍土思。對于植物樣本，尤其是重復(fù)序列較多的樣本忆嗜，unique mapped reads 比例可能會急劇降低己儒。
在獲取unique mapped reads后，要進行進一步過濾捆毫，以識別真正有效的interaction reads闪湾。
圖8.三種比對過程識別的無效數(shù)據(jù)
根據(jù)HiC實驗的基本原理PLA(proximity ligation assay)：空間上相互靠近的片段更有機會被連接在一起。因此僅且僅有兩個來源不同的片段連接在一起才會被認(rèn)為是標(biāo)準(zhǔn)的文庫片段绩卤。而這片段是指利用限制性內(nèi)切酶酶切的Fragments途样，即唯有兩個片段能分別比對到兩個不同的酶切片段上，且實際片段大斜舯铩（observe）符合理論的片段大小娘纷，在分析是才會將其歸類到valid pairs中。
圖9.Hi-C數(shù)據(jù)過濾
因此在分析過程中會將部分無效的數(shù)據(jù)進行過濾跋炕，首先是如果兩個片段原本通過一個酶切位點連接在一起，在HiC文庫中如果該片段即使酶切后添加生物素仍然連接在一起律适，該片段會被歸類到Re-ligation reads中辐烂；
而如果兩個的reads比對到同一個fragment遏插，但是方向相反，則該reads會被認(rèn)為是首尾相連形成了S**elf-circle **纠修；
如果pair end 同時比對到一個酶切片段上胳嘲，則該片段會被認(rèn)為是Dangling ends；
如果有一個發(fā)現(xiàn)是adapter污染扣草，該reads會被認(rèn)為是Adapter polluted;
如果兩側(cè)的end均能比對到基因組的兩個酶切片段中了牛，但是觀測到的片段大小與理論的片段大小不一致，則該片段會認(rèn)為是錯誤連接而被歸類為Dumped reads辰妙；
只有比對到兩個酶切片段且片段的理論值等于實際值的reads鹰祸，才會被認(rèn)為是Valid pair reads。
在這里我們解釋下Dangling ends和Dumped的成因密浑。
Dangling ends 主要來源于兩部分蛙婴，①經(jīng)DNA連接酶連接反應(yīng)后，攜帶生物素的DNA片段末端并未形成嵌合片段尔破，在末端生物素切割的（klenow）時又未將末端的生物素去除街图，從而進入到最終的文庫中；②磁珠洗脫步驟未完全將非特異性結(jié)合的DNA洗脫下來懒构。有文章報道餐济，只有將Dangling Ends的比例控制子啊10-45%以下才會被認(rèn)為是成功的Hi-C文庫8）。
Dump的主要原因在于酶的星號活性導(dǎo)致切割位點不在經(jīng)典的位點胆剧，這有可能是酶切時間過長或反應(yīng)體系中鹽離子濃度和種類不合適導(dǎo)致的絮姆；另外一個原因是片段被DNA外切酶降解，使得片段的大小發(fā)生了改變赞赖。
獲得了interaction reads后滚朵，要去除文庫中完全一樣的reads，因為這部分可能是由于PCR擴增導(dǎo)致的Duplication前域，去除Duplication后辕近，Valid pairs數(shù)據(jù)可用于后續(xù)的滑bin統(tǒng)計分析了。
最后匿垄，對分享的內(nèi)容進行總結(jié)移宅。
判斷HiC的文庫是否合格的一個重要的指標(biāo)是cis/trans的比值，一般認(rèn)為cis interaction比例越高椿疗，表明該數(shù)據(jù)的質(zhì)量越好漏峰。如果tran interaction的比例高于cis interaction的比例，則要慎重檢查實驗操作步驟是否出現(xiàn)紕漏届榄。
對于植物樣本浅乔，尤其是大基因組的植物樣本，其unique mapped的比例可能較低，此時為了達到足夠的數(shù)據(jù)量靖苇，需要提高測序深度席噩；然而如果對于人鼠等動物樣本，如果unique mapped ratio較低則可能是實驗原因贤壁。
在unqiue mapped數(shù)據(jù)過濾步驟中dangling ends 過高可能是末端生物素去除不完全或磁珠洗脫步驟中出現(xiàn)問題所致悼枢。如果dump的比例過高則可能是樣品發(fā)生了降解或星號活性。
最后一步去除PCR duplication脾拆，如果該步驟中duplication比例過高馒索，則表明PCR循環(huán)數(shù)過高導(dǎo)致。
Hi-C實驗步驟繁多名船，一份好的Hi-C實驗數(shù)據(jù)需要實驗人員針對不同的樣本進行實驗優(yōu)化及在整個實驗周期每個步驟用心地操作绰上。出現(xiàn)不如人意的實驗結(jié)果對于新手而言是正常的，此時就要對數(shù)據(jù)進行仔細(xì)分析包帚，并將自己融入到實驗的每個細(xì)節(jié)中細(xì)細(xì)體會渔期，才會有所收獲。最后給大家一個建議渴邦，多看看最近發(fā)表的文章疯趟，比較每個protocol的細(xì)微差別，如頡偉老師9）和陳陽老師5）今年發(fā)表的文章谋梭。相信看完后信峻，會有自己的體會。
參考文獻
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