陳巍學基因系列視頻可以說是一個非常有名的學習視頻了址貌，去年剛開始接觸生信的時候聽過其中的一些視頻，講的非常容易理解预明，可以在優(yōu)酷上看完整系列瑰谜。

這篇筆記是把其中甲基化測序這一視頻進行文字化，這樣不方便看視頻的時候可以隨時翻看筆記侈离。

視頻地址(youtube地址)：https://www.youtube.com/watch?v=UvEt_O3LQQc
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什么是DNA甲基化？

DNA的甲基化是在DNA的序列不變的條件下筝蚕，在其中某些堿基上加上甲基的這樣一個過程卦碾。DNA甲基化的結(jié)果，一般是使甲基化位點的下游的基因表達量變少起宽。

甲基化的核心化學反應(yīng)是什么洲胖？

這個分析方法當中的核心化學反應(yīng)，是用亞硫酸氫鹽來處理DNA坯沪。DNA當中绿映，沒有甲基化或羥甲基化的C堿基，就會被轉(zhuǎn)化成U堿基腐晾。我們來看這個轉(zhuǎn)化的過程叉弦，在弱酸性條件下，亞硫酸氫根會結(jié)合到?jīng)]有甲基化的C堿基的6位藻糖。而甲基化了的C堿基不會和亞硫酸氫根發(fā)生反應(yīng)的淹冰。然后用堿來處理。結(jié)合了亞硫酸氫根的非甲基化的C巨柒，就被脫氨基樱拴，并且脫亞硫酸根。從而被轉(zhuǎn)化成U堿基洋满。

而甲基化或者羥甲基化的C堿基晶乔，因為之前沒有和亞硫酸氫根起反應(yīng)，所以現(xiàn)在用堿來處理牺勾，它也不會發(fā)生脫氨基反應(yīng)正罢。所以，它還保持了是“C”驻民。用亞硫酸氫鹽來處理DNA腺怯，可以讓99%左右的非甲基化的C堿基變成U。轉(zhuǎn)化效率達到了99%川无。接下來通過高通量測序的方法呛占，可以精確地看到單個堿基的甲基化的水平。經(jīng)過亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化過的DNA懦趋，再經(jīng)過PCR晾虑，PCR新合成出來的鏈，U堿基的位置，就會被替換成了“T”帜篇。在接下來的測序過程中糙捺，測到的也是T堿基。而甲基化的C笙隙，因為沒有被亞硫酸氫鹽所轉(zhuǎn)化洪灯，所以，在接下來的測序過程中竟痰，被測到的還是“C”堿基签钩。通過測序，看一個位置是“C”坏快，還是“T”铅檩。如果它保持是“C”，就說明這個位置是被甲基化莽鸿、或者羥甲基化了昧旨。如果測到的是“T”，就說明這個位置是沒有被甲基化祥得、或者羥甲基化兔沃。

建庫方法有哪些？

方法一

用Illumina公司的Truseq DNA建庫方法：

因為Illumina Truseq DNA建庫試劑盒當中级及，它所提供的接頭上的C堿基都是已經(jīng)甲基化的了粘拾。所以，用這些接頭做出來的文庫创千，在用亞硫酸氫鹽做轉(zhuǎn)化的過程當中缰雇，它的（接頭上的）C還是保持是C ，不會被轉(zhuǎn)成U追驴。帶了這些接頭的文庫分子械哟，就可以和測序芯片上的草皮DNA發(fā)生互補雜交。并且進一步發(fā)生橋式PCR反應(yīng)殿雪。生成測序用的DNA的簇（Cluster）暇咆。

缺點: 用亞硫酸氫鹽處理DNA文庫的時侯，90%以上的DNA鏈會斷掉丙曙。這樣爸业，已經(jīng)建好的文庫，其中90%分子會被破壞掉亏镰。也就是說文庫的豐富度就會損失90%以上扯旷。
優(yōu)點：在建庫過程當中用的PCR循環(huán)數(shù)較少。所以由于PCR擴增效率不同所引起的文庫不均一程度也就較低索抓。也就是我們通常所說的PCR bias較少钧忽。

方法二

為了解決文庫豐富度受到損失的這個問題毯炮，EpiCentre公司開發(fā)了EpiGnome方法，方法的操作過程如圖耸黑。

第1步桃煎，亞硫酸氫鹽先處理DNA，把未甲基化的C都轉(zhuǎn)變成U大刊。
第2步为迈，把帶標簽1的隨機引物加入，進行第一次的復(fù)制缺菌。得到第1條的復(fù)制鏈葫辐。
第3步，消化掉過量的引物男翰。
第4步另患，加入帶末端終止堿基纽乱、并帶標簽2的隨機引物蛾绎。這個引物的作用是讓第1復(fù)制鏈延伸，并且加上標簽2鸦列。
第5步租冠，加入建庫的PCR引物，進行PCR薯嗤。通過PCR顽爹，把Index序列和成簇引物序列加入到鏈的兩側(cè)。得到真正的文庫骆姐。

優(yōu)點：把亞硫酸氫鹽處理的過程镜粤，放在了建庫之前。這樣建成的庫的豐富程度會比較高玻褪。
缺點：較多的PCR循環(huán)肉渴，PCR產(chǎn)物的擴增均一性不是很好。也就是說PCR bias會比較大带射。

上述兩種建庫方法各有優(yōu)缺點同规。

測序平臺是什么？

在Illumina的HiSeq 2000或者2500平臺上進行測序窟社，如果文庫是堿基平衡的文庫券勺，也就是說，每個循環(huán)當中灿里，A/C/G/T四種堿基的比例关炼，各占25%左右的話，測序儀對堿基的判讀會比較好匣吊。但是如果缺少了一種或者幾種堿基盗扒，測序儀對堿基的判讀就會出問題跪楞。測序得到的數(shù)據(jù)質(zhì)量就會下降。并且有效的數(shù)據(jù)產(chǎn)量也會降低侣灶。因為甲基化文庫中經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理甸祭，絕大多數(shù)的C都變成了T。所以這個文庫中是嚴重地缺少C堿基的褥影，也就是四種堿基的比例是嚴重不平衡的池户。這樣在用HiSeq 2000或2500測序儀來測甲基化文庫的過程當中，文庫測序得到的數(shù)據(jù)質(zhì)量較差凡怎。并且經(jīng)過PF過濾得到的有效的數(shù)據(jù)產(chǎn)量也會較低校焦。為了彌補甲基化文庫的堿基不平衡性，一般情況下统倒，在上機過程當中寨典，是摻入大比例的基因組文庫，或者PhiX文庫房匆，來補充比較多的C堿基耸成，一般會摻30%的PhiX文庫、或者基因組文庫浴鸿。在摻入30%的PhiX文庫的條件下井氢，一條HiSeq 2000 V3 PE100的Lane，大概可以得到20G 左右的甲基化文庫數(shù)據(jù)岳链。也就是說花竞，在HiSeq 2000或者2500平臺上，甲基化文庫的測序數(shù)據(jù)產(chǎn)量掸哑，一直都不是很高约急。質(zhì)量也比較低。

如何區(qū)分羥甲基化和甲基化苗分？

在用單純的亞硫酸氫鹽法來測的過程當中厌蔽，甲基化和羥甲化的C堿基都不能被轉(zhuǎn)化成U堿基，所以單純的亞硫酸氫鹽法是無法區(qū)分甲基化或羥甲基化的C堿基的俭嘁。為了區(qū)分甲基化和羥甲基化躺枕，目前有兩種方法：

方法一

通過高釕酸鉀（KRuO4）來氧化羥甲基化的C。羥甲基化的C可以被轉(zhuǎn)化成甲豕┨睿化的C堿基拐云，而甲酰化的C堿基近她，是可以被亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化成U的叉瘩。而甲基化的C，不會被轉(zhuǎn)化成U粘捎。這樣就把原來的羥甲基化的C和甲基化的C給區(qū)分開來了薇缅。

用高釕酸鉀氧化的方法來氧化羥甲基化的C危彩，其轉(zhuǎn)化效率是94%左右。也就是說泳桦，每100個羥甲基化的C中汤徽，有94個會被高釕酸鉀轉(zhuǎn)化成甲酰化的C灸撰。并進一步被亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化成U谒府。同時，原來的甲基化的C浮毯，只有2.1%會被轉(zhuǎn)化成甲跬暌撸化的C。

方法二

用糖基把羥甲基化的C給保護起來债蓝。然后用TET蛋白（Ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase 1）壳鹤，把甲基化的C轉(zhuǎn)化成羥基化的C。

進一步將羥基化的C轉(zhuǎn)化成甲跏渭＃化的C和羧基化的C芳誓。甲酰化的C和羧基化的C都可以被亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化成U蹦锋。而之前被糖基化保護起來的羥甲基化的C兆沙，是不會被TET蛋白轉(zhuǎn)化成甲跖费浚化的C或者羧基化的C的莉掂。在亞硫酸氫鹽的處理過程中，它還保持是C千扔。并且在之后的PCR擴增產(chǎn)物中憎妙，也表現(xiàn)為C。這樣就可以把羥甲基化的C曲楚，和甲基化的C厘唾，區(qū)分開來。用這個方法龙誊，沒有甲基化的C抚垃，99.6%都被轉(zhuǎn)化成了U。甲基化的C趟大，97.7%都被轉(zhuǎn)化成了U鹤树。而羥甲基化的C，只有8%被化成了U逊朽。也就是說92%的羥甲基化的C得到了糖基的保護罕伯，還保持了C。上述叽讳，就是目前2個區(qū)分羥甲基化的C和甲基化C的方法追他。

在甲基化文庫建程當中坟募，亞硫酸氫鹽對未甲基化的C的轉(zhuǎn)化效率并不是100%，一般是在99%左右邑狸。為了對實驗的轉(zhuǎn)化效率進行質(zhì)量控制懈糯。一般會在轉(zhuǎn)化實驗當中加入內(nèi)參對照品。一般情況下单雾，是用甲基化酶缺陷型的大腸桿菌昂利，所生產(chǎn)出來的完全沒有被甲基化的λ（噬菌體）DNA，或者pUC19（質(zhì)粒）DNA做內(nèi)參铁坎。來看一次實驗當中C的轉(zhuǎn)化效率蜂奸。一般情況下，實驗當中是加入1%的完全沒有甲基化的λ DNA做內(nèi)參硬萍。同樣道理扩所，也可以通過用甲基化酶處理過的，CpG島完全被甲基化的DNA朴乖，來跟蹤甲基化DNA對亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的抵抗效果祖屏。

測序后的數(shù)據(jù)如何處理？

因為亞硫酸氫鹽處理過后买羞，絕大部分的C都被轉(zhuǎn)化成了T袁勺。這樣，測出來的序列在和基因組進行對比的時侯畜普，直接對比是對比不上的期丰。為了進行比對，就要把基因組的堿基做兩種轉(zhuǎn)變：

第一種轉(zhuǎn)變是把基因組上所有的C都改到T吃挑，再來和測序測到的序列來對比钝荡。這樣就可以把原來的鏈對比上。

第二種轉(zhuǎn)變舶衬，是把基因組上所有的G都變成A埠通，這樣才能和經(jīng)過PCR得到的原樣本鏈上的互補鏈對比得上。這樣做的原因逛犹，是原樣本鏈的互補鏈端辱，它上面絕大部分的G，都被變成了A虽画。所以舞蔽，只有把（參考）基因組上的G，也都改成A狸捕，這樣才能對比得上喷鸽。比對上之后，再來看哪些堿基是沒有被轉(zhuǎn)化的灸拍。就可以確認這些堿基的甲基化修飾情況了做祝。

當然還有其他的一些方法可以檢測基因組里的甲基化水平砾省，這個視頻里并沒有把所有的方法介紹一遍。這里有一篇文章寫的比較全混槐，可以參考：DNA甲基化測序方法介紹