腸神經(jīng)系統(tǒng)（ENS）協(xié)調(diào)腸道運(yùn)動(dòng)羔杨、消化和屏障防御。在人體當(dāng)中杨蛋，腸神經(jīng)系統(tǒng)可分為腸肌叢和粘膜下叢兜材，而且其復(fù)雜程度可與脊髓媲美。在ENS的復(fù)雜系統(tǒng)中逞力，差異的腸道區(qū)域曙寡、物種、年齡掏击、性別卵皂、晝夜節(jié)律和疾病都會(huì)導(dǎo)致ENS異質(zhì)性。此外砚亭，許多腸道和腸道外疾病都與ENS功能障礙有關(guān)灯变，這些疾病包括直接影響腸道神經(jīng)元的單基因神經(jīng)病（如赫希-斯隆氏餐北臁）添祸，以及伴有早發(fā)腸道運(yùn)動(dòng)障礙的復(fù)雜神經(jīng)系統(tǒng)疾病（如自閉癥譜系障礙和帕金森惭罢獭）等刃泌。總之署尤，ENS協(xié)調(diào)著腸道中的各種功能并發(fā)揮著關(guān)鍵的作用耙替，但由于細(xì)胞的稀有性和多樣性，ENS的細(xì)胞組分及特征仍不清楚曹体。
2020年9月17日俗扇，美國(guó)麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué)Broad研究所的Aviv Regev教授團(tuán)隊(duì)在?Cell?雜志上發(fā)表了一篇題為?The Human and Mouse Enteric Nervous System at Single-Cell Resolution?的研究論文。在該研究中箕别，作者開(kāi)發(fā)了兩種方法（RAISIN RNA-Seq铜幽，MIRACL-Seq）來(lái)實(shí)現(xiàn)高兼容度的ENS單核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（snRNA-seq）和分析滞谢。作者對(duì)小鼠回腸、小鼠結(jié)腸和人結(jié)腸的160萬(wàn)個(gè)細(xì)胞核進(jìn)行了分析除抛，描繪了一張單細(xì)胞分辨率的跨物種ENS細(xì)胞圖譜狮杨，揭示了小鼠神經(jīng)元的多樣性以及基因表達(dá)特征與晝夜節(jié)律、疾病之間的關(guān)系到忽，表征了人腸神經(jīng)元中具有的保守和特異性的轉(zhuǎn)錄特征并闡述了其與神經(jīng)上皮橄教、神經(jīng)機(jī)制和神經(jīng)免疫之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。
01?成年小鼠ENS的RAISIN?RNA-Seq測(cè)序鑒定21個(gè)神經(jīng)元和3個(gè)膠質(zhì)細(xì)胞亞群
為了開(kāi)發(fā)更廣泛的組織兼容腸道snRNA-seq方法绘趋，作者首先系統(tǒng)地優(yōu)化小鼠結(jié)腸的細(xì)胞核提取條件颤陶，測(cè)試多種洗滌劑颗管、洗滌劑濃度陷遮、緩沖液、機(jī)械提取方法以及改良劑垦江，并與已發(fā)表的方案進(jìn)行了比較帽馋，最終確定了兩種具有高ENS回收率、低污染的提取物：CST（0.49% CHAPS去垢劑比吭、鹽和Tris緩沖液）和TST（0.03% Tween 20 去垢劑绽族、鹽和 Tris 緩沖液）。此外衩藤，為了驗(yàn)證兩提取體系下的核產(chǎn)物完整性吧慢，作者對(duì)兩種方法下的核產(chǎn)物進(jìn)行了透射電鏡（TEM）觀察，發(fā)現(xiàn)CST留了核膜和核外膜上的核糖體（命名為核糖體和完整單核赏表，RAISIN-seq）检诗，TST保留了核膜和附著的核糖體以及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（命名為細(xì)胞的完整細(xì)胞核和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，INNER Cell-seq）瓢剿。由于RAISIN RNA-seq比INNER Cell RNA-seq 捕獲的神經(jīng)元更多逢慌，污染的細(xì)胞數(shù)量更少，因此作者采用RAISIN RNA-seq對(duì)小鼠和人體ENS進(jìn)行后續(xù)研究间狂。作者利用 RAISIN RNA-seq和SMART-Seq2全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序攻泼，從29只年齡、性別鉴象、基因型以及取樣時(shí)間節(jié)點(diǎn)各不相同的成年小鼠結(jié)腸組織進(jìn)行了snRNA-seq忙菠，最終共得到了5,696個(gè)高質(zhì)量單核數(shù)據(jù)。經(jīng)過(guò)分析纺弊，作者將得到的細(xì)胞核分為21個(gè)神經(jīng)元亞群和3個(gè)神經(jīng)膠質(zhì)亞群牛欢，并富集了已知的ENS生物標(biāo)志物。
02?小鼠結(jié)腸ENS表達(dá)程序受腸道位置俭尖、晝夜節(jié)律和年齡的影響
作者進(jìn)一步利用回歸框架對(duì)差異腸道位置氢惋、晝夜節(jié)律節(jié)點(diǎn)洞翩、性別和年齡有關(guān)的差異基因進(jìn)行了探究。作者發(fā)現(xiàn)來(lái)自遠(yuǎn)端結(jié)腸的神經(jīng)元有更高的多種神經(jīng)遞質(zhì)受體表達(dá)焰望，包括血清素（Htr3a和Htr3b）骚亿、谷氨酸（Gria3和Grid1）和乙酰膽堿（Chrna7和Chrm1）受體。在對(duì)不同區(qū)域的差異表達(dá)進(jìn)行比較分析時(shí)熊赖，作者發(fā)現(xiàn)近端結(jié)腸的Sst表達(dá)較高来屠，而遠(yuǎn)端結(jié)腸的嗜鉻粒蛋白B(Chgb)、腦啡肽(Penk)震鹉、去甲腎上腺素(NE)俱笛、分泌粒蛋白II(Scg2)和Vip表達(dá)較高。在晝夜節(jié)律有關(guān)的差異表達(dá)比較中传趾，作者發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵節(jié)律調(diào)控因子（Arntl）在早晨和傍晚（Per1迎膜、Per2和Per3）存在明顯的時(shí)間相關(guān)差異表達(dá)規(guī)律。ENS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因（如Scg2和Pcsk1n）浆兰、神經(jīng)免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因（如Calcb和Il13ra1）和細(xì)胞骨架基因（如Tubb2a和Prph）在早晨被誘導(dǎo)磕仅；在傍晚，轉(zhuǎn)錄因子（如Nr1d2簸呈、Tef和Dbp）存在富集榕订。此外，老年小鼠的神經(jīng)元顯示出許多基因的失調(diào)蜕便，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)（如Park2和Lrrk2劫恒，導(dǎo)致早發(fā)帕金森病的主要原因），與自閉癥譜系障礙（Ache和Foxp1）和肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥（ALS）（如Prph和Dctn1）有關(guān)的基因都隨著衰老而失調(diào)轿腺。
03?利用MIRACL-Seq繪制人類腸道神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄圖譜
為了提高人體ENS單細(xì)胞核測(cè)序的有效性两嘴，作者進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了MIRACL-seq數(shù)據(jù)處理方法（在液滴中生成高通量的單個(gè)細(xì)胞核/細(xì)胞數(shù)據(jù)，并通過(guò)該方法從復(fù)雜組織中得到稀有細(xì)胞類型）吃溅，并以此方法構(gòu)建了人類結(jié)腸的ENS圖譜溶诞。作者對(duì)16名結(jié)直腸癌患者結(jié)腸切除術(shù)中與癌癥相鄰區(qū)域的細(xì)胞核進(jìn)行了測(cè)序分析，共得到了436,202個(gè)高質(zhì)量細(xì)胞核决侈。在綜合分析中螺垢，鑒定到了多種細(xì)胞類型（神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞赖歌、脂肪細(xì)胞枉圃、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞庐冯、免疫細(xì)胞孽亲、ICC 和肌細(xì)胞）和能反映了罕見(jiàn)的細(xì)胞類型或位置或細(xì)胞狀態(tài)的差異的患者特異性亞群。數(shù)據(jù)中展父，1,445個(gè)人神經(jīng)元聚集成14個(gè)亞群：4個(gè)PEMN（擬興奮運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元）返劲、5個(gè)PIMN（抑制性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元）玲昧、2個(gè)PIN（擬中間神經(jīng)元）、1個(gè)PSN（擬感覺(jué)神經(jīng)元）和2個(gè)PSVN（擬分泌運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元）亞群篮绿。在綜合小鼠結(jié)腸ENS圖譜和人結(jié)腸ENS的跨物種比較分析中孵延，作者發(fā)現(xiàn)小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中合成乙酰膽堿（ACh）所必需的膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)體SLC5A7在人ENS中也有表達(dá)。此外亲配，CHAT和SLC5A7的平均表達(dá)水平在兩個(gè)物種的神經(jīng)元亞群中都有很強(qiáng)的相關(guān)性尘应。
04?腸神經(jīng)元表達(dá)與結(jié)腸中多種細(xì)胞類型相互作用的基因
為了進(jìn)一步研究人結(jié)腸ENS與其他結(jié)腸細(xì)胞類型之間的相互作用，作者將數(shù)千個(gè)受體配體對(duì)與來(lái)自人類結(jié)腸粘膜的115,517個(gè)單細(xì)胞一起映射到本研究的數(shù)據(jù)中吼虎。這些數(shù)據(jù)跨越了不同的ENS犬钢、上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞思灰。在細(xì)胞-細(xì)胞相互作用分析中玷犹，作者首先復(fù)現(xiàn)了經(jīng)典的蠕動(dòng)反射回路（從腸內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生Tph1到最終的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元通過(guò)釋放ACh和速激肽(Tac1)或NO激活或抑制肌肉收縮，從而導(dǎo)致蠕動(dòng)）官辈。接下來(lái)箱舞，作者生成了配體及其受體在各自細(xì)胞亞群中強(qiáng)富集的ENS相互作用網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)人和小鼠的腸內(nèi)分泌細(xì)胞通過(guò)神經(jīng)肽胰高血糖素（GCG-GCGR/GLP2R）拳亿、肽YY（PYY-NPY1/2/ 5R）和胰泌素（SCT-SCTR）向不同的神經(jīng)元亞群發(fā)出信號(hào)；而在小鼠中愿伴，它們還通過(guò)Sst（Sstr1/2/3/5）發(fā)出信號(hào)肺魁。此外，作者還描繪了神經(jīng)元與其他細(xì)胞類型之間的預(yù)測(cè)相互作用路徑隔节，如小鼠PEMN3與淋巴細(xì)胞（Cxcl12-Ackr3）鹅经、小鼠PSN1與轉(zhuǎn)運(yùn)擴(kuò)增細(xì)胞（Grp-Grpr）、人PIN1與脂肪細(xì)胞（ADIPOQ-ADIPOR1）以及人PIMNs與RSPO3+成纖維細(xì)胞（CCL7/19-CCR10）等怎诫。
結(jié)論和意義
在該研究中瘾晃，作者圍繞ENS單核測(cè)序（snRNA-seq）開(kāi)發(fā)并應(yīng)用了兩種研究方法（RAISIN RNA-Seq，MIRACL-Seq）幻妓，并以此來(lái)系統(tǒng)地解析人和小鼠ENS神經(jīng)元的多樣性蹦误、基因表達(dá)特征和ENS與腸道區(qū)域、物種肉津、晝夜節(jié)律强胰、年齡和疾病之間的潛在聯(lián)系，為進(jìn)一步理解腸道神經(jīng)系統(tǒng)在多種疾病發(fā)病過(guò)程中扮演的角色妹沙、明確相關(guān)疾病的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素和相關(guān)特殊細(xì)胞類型提供了新的參考資料和理論基礎(chǔ)偶洋。
參考文獻(xiàn)：
Drokhlyansky E, Smillie CS, Van Wittenberghe N, Ericsson M, Griffin GK, Eraslan G, Dionne D, Cuoco MS, Goder-Reiser MN, Sharova T, Kuksenko O, Aguirre AJ, Boland GM, Graham D, Rozenblatt-Rosen O, Xavier RJ, Regev A. The Human and Mouse Enteric Nervous System at Single-Cell Resolution. Cell. 2020 Sep 17;182(6):1606-1622.e23. doi: 10.1016/j.cell.2020.08.003. Epub 2020 Sep 3. PMID: 32888429; PMCID: PMC8358727.
