1前言
隨著生命科學(xué)的發(fā)展進(jìn)入分子水平愤诱，有人預(yù)言21世紀(jì)將是檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的世紀(jì)，即從分子水平對疾病進(jìn)行診斷和治療捐友。這就要求臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)準(zhǔn)確淫半、快速、簡便匣砖、標(biāo)本微量化科吭、方法標(biāo)準(zhǔn)化、且經(jīng)濟(jì)實(shí)用猴鲫。生物傳感器正是在此要求下出現(xiàn)的一類跨領(lǐng)域对人、多學(xué)科的前沿診斷儀器。
國內(nèi)外對生物傳感器展開了廣泛深入地研究拂共，已經(jīng)研制出了葡萄糖生物傳感器规伐、乳糖生物傳感器、尿酸酶生物傳感器匣缘、DNA生物傳感器、BOD生物傳感器鲜棠、測酚生物傳感器等多種類別的生物傳感器肌厨，來滿足人們在臨床檢驗(yàn)、環(huán)境監(jiān)測和生化分析[1-3]等領(lǐng)域中的需求豁陆。
本實(shí)驗(yàn)將納米二氧化硅凝膠和尿酸酶緊貼于蛋膜上柑爸，將酶膜緊貼于普魯士藍(lán)（PB）修飾的玻碳電極表面，然后以自制鉑片電極為對電極盒音、甘汞電極為參比電極表鳍，組成三電極體系馅而，制成尿酸酶生物傳感器。當(dāng)體液中的尿酸通過酶膜時(shí)譬圣，與酶進(jìn)行反應(yīng)瓮恭，檢測出該處產(chǎn)生的反應(yīng)電流，然后將其換算成尿酸濃度加以顯示厘熟。應(yīng)用尿酸酶傳感器測定人體血和尿中尿酸的濃度屯蹦，是一種準(zhǔn)確、快速绳姨、簡便的方法登澜，可幫助診斷腎炎、白血病和腫瘤等疾病飘庄。
2? 尿酸酶生物傳感器的工作原理
尿酸酶生物傳感器的工作原理是：尿酸在尿酸酶作用下脑蠕，被分子氧氧化成尿囊素，并產(chǎn)生二氧化碳和過氧化氫跪削。根據(jù)反應(yīng)前后氧的消耗谴仙，我們用電極監(jiān)測溶液中氧的變化，就可推算出尿酸的濃度切揭，其工作機(jī)理[4]如圖2：
圖1尿酸在尿酸酶作用下的反應(yīng)機(jī)理
Figure1 Principle of uric acid under the uricase
3? 實(shí)驗(yàn)部分
3.1 儀器與試劑
試劑：尿酸酶（4.6units/mg狞甚， Sigma公司），牛血清白蛋白（BR）廓旬，戊二醛（CP）哼审，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀（AR）孕豹，氯化鈉(AR)涩盾，雞蛋，氣透膜励背，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水春霍。
儀器：玻碳電極（天津蘭力天儀器有限公司），鉑電極（自制叶眉，鉑片長×寬×厚為5×4×0.25mm）址儒，甘汞電極（上海雷磁），CHI600型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)衅疙。
3.2 尿酸酶電極的制備
取新鮮雞蛋殼小心剝離蛋膜莲趣，依次用NaCl溶液、蒸餾水清洗饱溢；稱取12.5mg牛血清白蛋白（BSA）溶于250μL 10g?L-1尿酸酶溶液中喧伞；將蛋膜鋪于潔凈的玻片上，小心裁取直徑為1cm的圓形膜；在膜上依次滴加25μL尿酸酶-牛血清白蛋白混合溶液潘鲫、改性納米二氧化硅凝膠液翁逞、5μL 2%戊二醛溶液，室溫放置3~4h溉仑，置4℃冰箱冷藏過夜挖函；過夜后的蛋膜用磷酸緩沖液(PBS)漂洗數(shù)次；將酶膜緊貼于PB修飾的玻碳電極表面彼念，覆蓋氣透膜挪圾，即制成尿酸酶電極[5,6]。
實(shí)驗(yàn)流程如圖2所示逐沙。
圖2 納米顆粒增強(qiáng)的尿酸酶電極制作示意圖
Figure2 Manufacture flow chart of nanoparticles strengthen uricase electrode
3.3 實(shí)驗(yàn)方法
采用三電極體系進(jìn)行檢測：飽和甘汞電極為參比電極哲思，制作的尿酸酶電極為工作電極，自制鉑片電極為對電極吩案，底液為0.1mol ·L-1的KCl 磷酸鹽緩沖溶液棚赔，在一定的溫度下進(jìn)行檢測。測量時(shí)徘郭，先將三電極置于緩沖溶液中靠益，加一電壓于工作電極(0.4ＶvsSCE)，當(dāng)背景電流值減小至一恒定值時(shí)残揉，將電極放至被測尿酸溶液中胧后，分別記錄不同時(shí)間的電流響應(yīng)值，扣除初始背景電流值抱环，即為被測尿酸離子濃度的電極電流響應(yīng)值壳快。
4? 影響因素分析
4.1 尿酸濃度的影響
測量不同濃度尿酸的響應(yīng)信號(hào)，使得電極響應(yīng)與尿酸濃度成很好的線性關(guān)系镇草，酶電極在不同濃度的尿酸中的循環(huán)伏安如圖3所示眶痰。確定尿酸酶生物傳感器檢測尿酸濃度的線性響應(yīng)范圍，如圖4 所示梯啤。實(shí)驗(yàn)測定尿酸濃度的線性響應(yīng)范圍為7.5×10-6~1.5×10-4mol·L-1竖伯。
圖3酶電極在不同濃度的尿酸中的循環(huán)伏安圖? ? 圖4尿酸濃度與響應(yīng)電流線性關(guān)系圖
Fig3 Cyclic voltammograms of the uricase biosensor? ? ? ? Fig4 Linear relationship’ chart of difference of urate standard in different concentration of uric acid? ? ? ? ? ? ? ? ? current response solutions on the urate biosensor
(a.112.5μg/mL, b.75μg/mL, c.37.5μg/mL, d.7.5μg/mL, e.0μg/mL)? ? ? ? ?
4.2 尿酸酶濃度的影響
向尿酸溶液中多次加入尿酸酶，以測定不同濃度尿酸酶對氧化峰電流的影響因宇。電流響應(yīng)隨著尿酸酶濃度從零到某濃度的增加而增加七婴。綜合考慮電流響應(yīng)和經(jīng)濟(jì)因素，選擇最適宜的尿酸酶濃度1.5U察滑。
4.3 納米二氧化硅的影響
酶電極的性能是由酶的催化活性本姥、酶活性中心和導(dǎo)電基質(zhì)之間電子交換速率決定的。納米顆粒比表面積大杭棵、表面自由能高，吸附能力較強(qiáng)，把納米顆粒引人到傳感器研究中魂爪，可以使更多的酶分子可以固定在納米顆粒表面先舷。另外，由于納米顆粒尺寸很小滓侍，有可能與酶內(nèi)部的FAD親水基團(tuán)發(fā)生作用蒋川，從而引起酶構(gòu)型上的變化。這種變化使得酶的活性中心FAD更接近底物撩笆，提高了酶的催化效率捺球。改性納米SiO2顆粒對生物分子具有很好的選擇吸附性，可望實(shí)現(xiàn)納米顆粒與酶分子活性中心及電極之間的直接電化學(xué)作用夕冲，大大增強(qiáng)生物傳感器的靈敏度氮兵。本實(shí)驗(yàn)對不添加納米二氧化硅、添加納米二氧化硅歹鱼、添加改性的納米二氧化硅泣栈，所制備的尿酸酶生物傳感器進(jìn)行了比較，實(shí)驗(yàn)證明納米二氧化硅有增強(qiáng)電流響應(yīng)信號(hào)的作用弥姻。
4.4 緩沖溶液pH值的影響?
緩沖溶液pH值對酶催化反應(yīng)速率和酶的活性有較大影響南片，如圖5所示。尿酸酶最適宜pH范圍較寬庭敦。綜合考慮酶的活性以及響應(yīng)電流的最大的靈敏度疼进，選擇最適宜的pH值6.5。
圖5 pH值對酶生物傳感器響應(yīng)信號(hào)的影響? ? 圖6 溫度對酶生物傳感器響應(yīng)信號(hào)的影響
Fig5 Effect of pH on the current response? ? ? Fig6 Cyclic voltammograms of the uricase biosensor
of the enzyne biosensor? ? ? ? ? ? ? ? ? ? in different temperature
(a.25℃, b.20℃, c.30℃, d.35℃, e.10℃)
4.5 溫度的影響
溫度的變化將影響酶的活性及酶催化反應(yīng)速率秧廉。在10~35℃范圍內(nèi)考察氧化峰電流與溫度的關(guān)系伞广，如上圖圖6所示。氧化峰電流隨溫度的升高而增大定血∨獍考慮溫度較高時(shí)酶易變性失活，選擇最適宜的溫度25℃澜沟。
4.6 工作電極的影響
將酶膜分別固定在鉑電極灾票、玻碳電極、石墨電極上茫虽，觀察響應(yīng)電流的靈敏度刊苍，選擇最適宜的固定電極-玻碳電極進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
5? 結(jié)論
本方法研制的尿酸酶生物傳感器具有操作簡單濒析、分析速度快正什、靈敏度高、所需試樣少的特點(diǎn)号杏，通過進(jìn)一步研究后婴氮，有望應(yīng)用于臨床斯棒，幫助診斷腎炎、白血病和腫瘤等疾病主经。
