上一篇介紹了使用ChIPseeker對peaks的分布和鄰近基因的注釋距潘。除此之外壹哺，下游分析通常還包括鑒定我們感興趣的蛋白質(zhì)結(jié)合的motif；鑒定這些結(jié)合區(qū)域的基因以及這些基因的富集通路或網(wǎng)絡(luò)。

學(xué)習(xí)目標(biāo)

• 功能富集分析: [GREAT](http://bejerano.stanford.edu/great/public/html/index.php)
• motif分析:MEME套件溶其，如DREME(http://meme-suite.org/tools/dreme), MEME-ChIP (http://meme-suite.org/tools/meme-chip)

準(zhǔn)備文件

提取IDR結(jié)果文件的前3列

cut -f 1,2,3 Nanog-idr-merged.bed  > Nanog-idr-merged-great.bed

使用bedtools getfasta提取peaks的序列

bedtools getfasta -fi \
ref_genome.fa \
-bed Nanog-idr-merged-great.bed \
-fo Nanog-idr-merged-dreme.fasta

富集分析

GREAT(http://bejerano.stanford.edu/great/public/html/index.php)對peaks的功能注釋是對peaks臨近基因的注釋。
方法：

• 1.打開GREAT網(wǎng)站：http://bejerano.stanford.edu/great/public/html/index.php 敦间。上傳Nanog-idr-merged-great.bed文件瓶逃，選擇參考基因組，選擇Whole genome作為背景區(qū)域廓块，然后點擊Submit厢绝。
  
• 2. 點開Job Description,選擇View all genomic region-gene associations，結(jié)果中的兩個表給出peaks注釋到的基因带猴，一個是基因組區(qū)域和基因關(guān)聯(lián)的表昔汉，一個是基因和基因組關(guān)聯(lián)的表：
     
• 3. Region-Gene Association Graphs
     這欄內(nèi)容對結(jié)合位點的基因數(shù)和轉(zhuǎn)錄起始位點相關(guān)的基因做了圖形展示。
     
• 4. Global Controls
     選擇想注釋的信息浓利，如GO注釋
     

• 5. 探究Nanog結(jié)合位點相關(guān)的GO BP term

     
     

• 6. 選擇某個term,查看具體信息

     
     
• 7. 打開This term's genomic region-gene association tables (140 regions, 116 genes)挤庇，查看注釋到的GO term相關(guān)的基因，可以下載表格贷掖。
     
     image.png
• 8. 在This term's gene -> genomic region association table中點擊基因相關(guān)的regions嫡秕，可以在UCSC瀏覽器上直接查看結(jié)合區(qū)域。

找Motif

motif是比較有特征的短序列苹威，會多次出現(xiàn)的昆咽，并被假設(shè)擁有生物學(xué)功能。而且，經(jīng)常是一些具有序列特異性的蛋白的結(jié)合位點（如轉(zhuǎn)錄因子）或者是涉及到重要生物過程的（如掷酗，RNA 起始调违，RNA 終止， RNA 剪切等等）泻轰。
有很多網(wǎng)頁版工具提供了找motif的方法技肩，2014年的一篇綜述列出了目前常用的網(wǎng)頁工具（https://doi.org/10.1186/1745-6150-9-4 ）：

DREME

• 打開DREME網(wǎng)頁 http://meme-suite.org/tools/dreme ，只要輸入fasta序列Nanog-idr-merged-dreme.fasta即可泳挥，同時可以寫上email和每個任務(wù)的描述然痊，任務(wù)完成時如右圖所示，可以打開DREAM_HTML_output查看結(jié)果屉符。
  
  
  DREME’s HTML展示的結(jié)果包括找到的motif的序列l(wèi)ogo和表示顯著性的E-value剧浸。點擊More可以查看更多的信息。
  
  
  Tomtom
  為了確定鑒定到的motif與已知轉(zhuǎn)錄因子的motif是否相似矗钟，可以將找到的motif再提交到Tomtom唆香，與已知的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫搜索匹配，同時還會給出motif-motif相似性的統(tǒng)計評估真仲。
  在DREAM's HTML結(jié)果中選擇某個預(yù)測到的motif袋马，點擊Submit / Download,然后選擇Tomtom，點擊Submit秸应，在新打開的Tomtom界面可以選擇轉(zhuǎn)錄因子的參考數(shù)據(jù)庫虑凛，保持默認(rèn)參數(shù)不變，也可以再添加其他參數(shù)软啼，輸入郵箱和任務(wù)描述就可以開始搜索桑谍。
  

MEME-ChIP

MEME-ChIP是MEME套件中的另一個工具，可以實現(xiàn)DREAM和Tomtom的分析功能祸挪，還可以評估m(xù)otifs的中心富集性并整合相關(guān)的motifs合成相似性簇锣披。MEME-ChIP能夠鑒定更長的motifs（<30bp）,但是運(yùn)行時間比較長。

參考資料

1. 哈佛深度NGS數(shù)據(jù)分析課程, 08-Web-based functional analysis and motif discovery
2. 找個motif嘛整以，簡單