doi： 10.1111 / bph.14793
背景和目的
在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者中，上皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）的L858R / T790M突變是治療獲得性耐藥的主要原因著摔，從而限制了它們的治療效果兼都。因此泄伪，鑒定能夠優(yōu)先治療具有L858R / T790M突變的NSCLC的藥物至關(guān)重要失都。在這里，我們?cè)u(píng)估了熊果酸（一種從草藥中分離的活性成分）對(duì)具有L858R / T790M突變的H1975細(xì)胞的影響庙曙。
實(shí)驗(yàn)方法
基因表達(dá)綜合（GEO）概況分析用于檢測(cè)攜帶EGFR突變的NSCLC細(xì)胞中差異表達(dá)的基因空镜。AnnexinV‐FITC / PI，TUNEL染色，MTT吴攒，傷口愈合张抄，RT‐PCR，qRT‐PCR舶斧，western blots欣鳖，免疫染色察皇，雙熒光素酶報(bào)告基因和ChIP‐PCR被用來(lái)研究熊果酸在體外和體內(nèi)的作用茴厉。
關(guān)鍵結(jié)果
癌癥抗原家族45成員A2（CT45A2）在H1975細(xì)胞中高度表達(dá)。H1975細(xì)胞中CT45A2的異位表達(dá)增加了體外細(xì)胞的增殖和運(yùn)動(dòng)能力什荣。沉默CT45A2的表達(dá)大大減弱了H1975細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和生長(zhǎng)矾缓。熊果酸的抗癌作用嚴(yán)重取決于H1975細(xì)胞中CT45A2的表達(dá)。熊果酸抑制轉(zhuǎn)錄因子TCF4和β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)介導(dǎo)的CT45A2基因轉(zhuǎn)錄稻爬。
結(jié)論
CT45A2是具有EGFR T790突變的NSCLC的新型致癌基因嗜闻。熊果酸通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)β-catenin/ TCF4 / CT45A2信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)H1975細(xì)胞凋亡并抑制其增殖。因此桅锄，熊果酸可能是具有EGFR-L858R / T790M突變的NSCLC的潛在候選治療藥物琉雳。
3.1。UA抑制具有EGFR L858R / T790M突變的H1975細(xì)胞的細(xì)胞增殖和運(yùn)動(dòng)
熊果酸抑制具有EGFR L858R / T790M突變的H1975細(xì)胞的細(xì)胞增殖和運(yùn)動(dòng)友瘤。（A）將H460翠肘，H1299，HCC827和H1975細(xì)胞與5μmolL -1的厄洛替尼孵育48小時(shí)辫秧，并通過(guò)MTT分析對(duì)細(xì)胞活力進(jìn)行分析束倍。（B）用齊墩果酸（OA，50μmolL -1）盟戏，甘草次酸（GA绪妹，50μmolL -1），熊果酸（UA柿究，50μmolL -1）邮旷，積雪草酸（AA，50）處理H1975細(xì)胞μmolL -1）和厄洛替尼（5μmolL -1）48小時(shí)蝇摸。通過(guò)MTT測(cè)定法在490nm的吸光度下測(cè)量細(xì)胞活力婶肩。（C）用不同濃度的UA，AA探入，GA狡孔，OA和厄洛替尼處理H1975細(xì)胞48小時(shí)。通過(guò)MTT測(cè)定法在490nm的吸光度下測(cè)量細(xì)胞活力蜂嗽。（D）不同濃度的UA和AA對(duì)人正常肺上皮（BEAS-2B）細(xì)胞的細(xì)胞毒作用苗膝。使用MTT測(cè)定法分析細(xì)胞活力。（E）將H1975細(xì)胞用UA（25μmolL -1）處理植旧，然后用AnnexinV-FITC和碘化丙啶染色以通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡辱揭。（F）用UA（25μmolL -1處理H1975細(xì)胞）在不同時(shí)間（24离唐、48、72小時(shí)）问窃，通過(guò)劃痕傷口愈合測(cè)定法評(píng)估細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性的變化亥鬓。比例尺= 500μm。顯示的數(shù)據(jù)是來(lái)自五個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SD（n = 5）域庇。* P <0.05嵌戈，如所示有顯著差異；ns听皿，無(wú)重大影響
3.2熟呛。UA在體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡
熊果酸（UA）抑制異種移植腫瘤的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)體內(nèi)凋亡。（A）將H1975細(xì)胞皮下注射到無(wú)胸腺裸小鼠的右背側(cè)尉姨。每天一次給小鼠注射UA（25 mg kg -1-1天-1）或溶媒（含1％DMSO的生理鹽水）或erlotinib（20 mg kg -1-1天-1）每天一次庵朝，持續(xù)18天。殺死小鼠并收集腫瘤組織又厉。尸檢時(shí)取每個(gè)治療組的小鼠和腫瘤的照片九府。（B）根據(jù)以下公式，通過(guò)測(cè)量單個(gè)腫瘤的2個(gè)直徑來(lái)計(jì)算腫瘤體積：腫瘤體積（mm 3）＝（長(zhǎng)×寬2 ×0.5）覆致。所示數(shù)據(jù)是從實(shí)驗(yàn)獲得的值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤侄旬。P <0.05，如所示有顯著差異篷朵。（C）上圖：顯示了代表性的腫瘤例子勾怒。下：每只小鼠的腫瘤重量。所示數(shù)據(jù)為平均值±SEM声旺。 P＜0.05笔链。（D）左：取自H1975異種移植物的腫瘤樣品，固定并石蠟包埋腮猖。切片用于通過(guò)TUNEL染色檢查凋亡細(xì)胞鉴扫。白色箭頭表示具有特征性凋亡形態(tài)的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞。顯示了代表性圖像澈缺。比例尺= 200μm坪创。右：圖中TUNEL染色結(jié)果的分析和統(tǒng)計(jì)?圖2D2D左。從5個(gè)高倍視野（HPF）量化TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量姐赡。（E）在H＆E染色后莱预，通過(guò)光學(xué)顯微鏡評(píng)估肝臟和腎臟樣品中的毒性程度。顯示了代表性圖像项滑。比例尺= 200μm依沮。顯示的數(shù)據(jù)是來(lái)自車輛組和UA組的五個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SD；厄洛替尼組的三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。* P <0.05危喉，與指示值顯著不同
3.3宋渔。CT45A2在帶有EGFR L858R / T790M的H1975細(xì)胞中高表達(dá)
CT45A2在具有EGFR L858R / T790M突變的H1975細(xì)胞中高表達(dá)。（A）分析對(duì)抗癌藥物吉非替尼具有廣泛敏感性的基線非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）細(xì)胞系辜限。GEO數(shù)據(jù)集結(jié)果用于定義吉非替尼敏感性的基因表達(dá)特征皇拣。吉非替尼對(duì)各種NSCLC品系（HG-U133B）的影響。ZDHHC24薄嫡，EREG氧急，RAP2B，GNA12岂座，EGLN1态蒂，CT45A2和TMEM18等基因在耐吉非替尼的H1975細(xì)胞中高度表達(dá)。（B）提取HCC827和H1975細(xì)胞的總RNA费什，并進(jìn)行Q-PCR檢查指示基因（ZDHHC24，EREG手素，RAP2B鸳址，GNA12，CT45A2）的mRNA水平泉懦。內(nèi)源GAPDH RNA用作內(nèi)部對(duì)照稿黍。（C）用過(guò)表達(dá)CT45A2的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H1975細(xì)胞，并通過(guò)MTT測(cè)定法測(cè)量細(xì)胞活力崩哩。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)指示的蛋白質(zhì)巡球。中間的圖顯示了來(lái)自蛋白質(zhì)印跡的平均值。通過(guò)Image J軟件使用灰度值分析對(duì)蛋白質(zhì)水平進(jìn)行定量邓嘹。（D）用針對(duì)CT45A2的siRNA（siCT45A2）或陰性對(duì)照siRNA（siNC）轉(zhuǎn)染H1975細(xì)胞酣栈，通過(guò)PCR檢測(cè)指示的基因。中間的圖顯示了PCR的平均值汹押。通過(guò)Image J軟件分析CT45A2 mRNA水平矿筝。通過(guò)MTT測(cè)定評(píng)估細(xì)胞活力。（E）用過(guò)表達(dá)CT45A2的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H1975細(xì)胞棚贾，并使用傷口愈合試驗(yàn)研究細(xì)胞遷移率窖维。比例尺= 500μm。（F）將H1975細(xì)胞用siCT45A2或siNC轉(zhuǎn)染妙痹。通過(guò)傷口愈合試驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性铸史。比例尺= 500μm。所示數(shù)據(jù)為五個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SD * 通過(guò)傷口愈合試驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性怯伊。比例尺= 500μm琳轿。顯示的數(shù)據(jù)為五個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SD * 通過(guò)傷口愈合試驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性。比例尺= 500μm。所示數(shù)據(jù)為五個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SD P <0.05利赋，與指示值顯著不同水评；ns，*無(wú)重大影響
3.4媚送。UA誘導(dǎo)的H1975細(xì)胞凋亡需要CT45A2
熊果酸（UA）在具有EGFR L858R / T790M突變的H1975細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中燥。（A）用CT45A2-pRK5-Flag或pRK5-Flag轉(zhuǎn)染H1975細(xì)胞，然后將其與UA（25μmol/ L）一起孵育24小時(shí)塘偎，并通過(guò)MTT增殖測(cè)定評(píng)估細(xì)胞活力疗涉。（B）用針對(duì)CT45A2的siRNA（siCT45A2）或陰性對(duì)照siRNA（siNC）轉(zhuǎn)染H1975細(xì)胞。通過(guò)PCR檢測(cè)到所指示的基因吟秩。通過(guò)MTT測(cè)定評(píng)估細(xì)胞活力咱扣。（C）將H1975細(xì)胞用UA（25μmolL -1）處理，然后用AnnexinV-FITC和碘化丙啶染色以通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡涵防。顯示的數(shù)據(jù)是來(lái)自五個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SD闹伪。* P <0.05，如所示有顯著差異壮池；ns偏瓤， 非重大影響
3.5。UA通過(guò)H1975細(xì)胞中的TCF4位點(diǎn)抑制CT45A2基因啟動(dòng)子
半定量檢測(cè)顯示椰憋，在耐吉非替尼的H1975細(xì)胞中上調(diào)的基因中厅克，UA被發(fā)現(xiàn)抑制CT45A2的mRNA表達(dá)，但不抑制其他基因（圖2）橙依。 ?（圖5a）5a）或在H1975細(xì)胞中進(jìn)行定量RT-PCR分析（圖 ?（圖5b）证舟。5b）。因此窗骑，我們假設(shè)UA可以在mRNA轉(zhuǎn)錄或mRNA衰變的水平抑制CT45A2基因的表達(dá)女责。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們使用放線菌素D（4μg ·ml -1）終止所有基因轉(zhuǎn)錄慧域，然后觀察了UA處理后H1975細(xì)胞中CT45A2的mRNA半衰期（圖?（圖5c）鲤竹。5C）。結(jié)果表明昔榴，UA無(wú)法影響CT45A2 mRNA的半衰期（圖?（圖5c辛藻，d）。5）互订。因此吱肌，UA介導(dǎo)的CT45A2下調(diào)很可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。
熊果酸（UA）通過(guò)H1975細(xì)胞中的TCF4位點(diǎn)抑制CT45A2基因啟動(dòng)子仰禽。（A）將HCC827和H1975細(xì)胞與UA（25μmolL -1）和厄洛替尼（5μmolL -1）孵育12小時(shí)氮墨。提取上述處理過(guò)的細(xì)胞的總RNA纺蛆，并進(jìn)行RT-PCR檢查指定基因（ZDHHC24，EREG规揪，RAP2B桥氏，GNA12，CT45A2）的mRNA水平猛铅。（B）用UA（25μmolL -1）和厄洛替尼（5μmolL -1）處理H1975細(xì)胞12小時(shí)字支。提取上述處理過(guò)的細(xì)胞的總RNA，進(jìn)行Q-PCR檢查指定基因（ZDHHC24奸忽，EREG堕伪，RAP2B，GNA12栗菜，EGLN1欠雌，CT45A2，TMEM18）的mRNA水平疙筹。內(nèi)源性β-肌動(dòng)蛋白R(shí)NA被用作內(nèi)部對(duì)照富俄。（C）UA（25μmolL -1）不會(huì)影響H1975細(xì)胞中CT45A2 mRNA的半衰期。UA處理H1975細(xì)胞4小時(shí)后腌歉，加入放線菌素D（Act D蛙酪，4μgmL -1）。在指定的時(shí)間收獲細(xì)胞用于總RNA提取翘盖，并通過(guò)PCR測(cè)量mRNA水平。GAPDH用作對(duì)照凹蜂。（D）通過(guò)半定量PCR分析評(píng)估CT45A2表達(dá)水平馍驯。（E）CT45A2啟動(dòng)子的序列缺失突變體分析。將H1975細(xì)胞用人CT45A2啟動(dòng)子-熒光素酶構(gòu)建體轉(zhuǎn)染玛痊，并在無(wú)UA或與UA（25μmolL -1）一起孵育12小時(shí)汰瘫。截?cái)嗟腃T45A2s的轉(zhuǎn)錄活性通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定法確定。（F）通過(guò)PROMO HOME PAGE預(yù)測(cè)人CT45A2基因的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)擂煞。（G）將在特定TCF4位點(diǎn)具有突變的CT45A2啟動(dòng)子構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中混弥，并測(cè)定熒光素酶活性以鑒定與UA調(diào)節(jié)CT45A2啟動(dòng)子活性有關(guān)的特異性TCF4結(jié)合位點(diǎn)。（H）敲除TCF4會(huì)降低H1975細(xì)胞中的CT45A2熒光素酶報(bào)道分子活性对省。（I）通過(guò)ChIP測(cè)定結(jié)合PCR研究了TCF4與CT45A2啟動(dòng)子的結(jié)合蝗拿。β-肌動(dòng)蛋白基因用作內(nèi)部對(duì)照。顯示的數(shù)據(jù)是來(lái)自五個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SD蒿涎。* P <0.05哀托，＃ P <0.05，如所示有顯著差異劳秋；ns仓手，無(wú)重大影響
3.6胖齐。UA在體內(nèi)外均抑制β-catenin/ TCF4信號(hào)通路
由于UA降低了CT45A2啟動(dòng)子上TCF4的結(jié)合；我們調(diào)查了TCF4是否參與了UA對(duì)CT45A2 mRNA水平的抑制嗽冒。將有或沒有用siNC或siTCF4轉(zhuǎn)染的H1975細(xì)胞暴露于UA并進(jìn)行半定量PCR呀伙。結(jié)果表明沉默TCF4后，CT45A2 mRNA水平顯著降低添坊。此外剿另，TCF4沉默后，UA對(duì)CT45A2基因表達(dá)的抑制作用大大減弱（圖?（圖6A）帅腌。6一種）驰弄。然后，我們?cè)u(píng)估了UA抑制H1975細(xì)胞增殖對(duì)TCF4的依賴性速客。MTT分析表明戚篙，在TCF4沉默的細(xì)胞中，UA對(duì)H1975細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用大大減弱（圖?（圖6B）溺职。6B）岔擂。此外，Annexin V-FITC / PI分析還顯示浪耘，TCF4沉默可顯著減弱UA誘導(dǎo)的H1975細(xì)胞凋亡（圖?（圖6C）乱灵，6C），表明UA的作用取決于TCF4七冲。
已知轉(zhuǎn)錄因子TCF4是發(fā)展和癌癥中Wnt /β-catenin信號(hào)通路的介體痛倚。因此，我們研究了UA對(duì)H1975細(xì)胞中Wnt /β-catenin/ TCF4信號(hào)通路的影響澜躺。如圖所示?圖6d6d蝉稳，與對(duì)照組相比，UA處理抑制了H1975細(xì)胞中Ser- 33 / 37 / Thr 41處β-catenin的磷酸化和TCF4的水平掘鄙，并誘導(dǎo)了Ser 9上GSK-3β的磷酸化耘戚。但是原环，UA對(duì)總β-catenin和GSK-3β的蛋白質(zhì)水平?jīng)]有顯著影響犯祠。UA還抑制了β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)毯焕，導(dǎo)致β-catenin水平顯著下降（圖?（圖6d现横，e）患膛。6d油湖，e）饰豺。因此晦闰，β-catenin/ TCF4信號(hào)通路參與了UA對(duì)TCF4表達(dá)的調(diào)節(jié)吧黄。
