葉綠體/線粒體在線注釋網(wǎng)站GeSeq

上篇介紹了一個線粒體在線注釋網(wǎng)站数焊，MITOS升筏，今天呢白魚小編繼續(xù)給大家推薦另一個在線注釋網(wǎng)站，GeSeq锭沟。該網(wǎng)站即可用于注釋線粒體祭衩，也可用于葉綠體诵竭。GeSeq主要以同源注釋的方式环形，快速準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)細(xì)胞器基因組的注釋总寻，特別是葉綠體基因組汗销。

GeSeq網(wǎng)站鏈接： https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/geseq.html GeSeq主要依據(jù)的同源比對的方法犹褒，即根據(jù)參考葉綠體/線粒體序列中的結(jié)構(gòu)區(qū)，和我們上傳的基因組進(jìn)行blast大溜、hmmer等同源比對化漆，在我們的基因組中尋找相似的區(qū)域，由此實(shí)現(xiàn)編碼基因钦奋、非編碼RNA等的“同步轉(zhuǎn)移”座云，從而實(shí)現(xiàn)對基因組的注釋。 因此付材，在使用該網(wǎng)站對我們的葉綠體/線粒體進(jìn)行注釋時朦拖，必需提供同種或近緣物種葉綠體/線粒體的參考序列(至少需要一個)，根據(jù)同源注釋的方法厌衔，獲得的結(jié)果通常也很準(zhǔn)確璧帝。 但若不存在近緣的參考基因組，則將無法準(zhǔn)確識別基因組中的結(jié)構(gòu)區(qū)富寿，這點(diǎn)特別體現(xiàn)在植物線粒體睬隶、葉綠體的注釋中，所以植物基因組的注釋页徐，即便是小基因組的注釋也一直是一件很讓人頭痛的事情苏潜。 目前在GeSeq中，蛋白編碼基因只能通過這種同源比對的方式獲得变勇； 對于基因組中的非編碼RNA區(qū)恤左，除了以同源比對的方式注釋外，GeSeq還提供了從頭預(yù)測的方法搀绣，即結(jié)合了tRNAscan-SE飞袋、ARAGORN等工具，可在缺乏近緣參考基因組的前提下盡可能注釋得到更多的非編碼RNA區(qū)链患。 除了結(jié)構(gòu)區(qū)注釋巧鸭，GeSeq還提供了繪制細(xì)胞器基因組圈圖的功能。 這樣麻捻，我們在拿到注釋結(jié)果后蹄皱，即可繼續(xù)使用它提供的功能繪制基因組圈圖览闰，方便快捷，且效果不輸circos巷折。

GeSeq使用簡介

GeSeq界面功能

打開GeSeq網(wǎng)站鏈接： https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/geseq.html压鉴，上傳序列，調(diào)節(jié)參數(shù)锻拘。 以下是對GeSeq界面的基本簡介油吭。

左側(cè)上傳序列(fasta文件)，并選擇基本選項(xiàng)署拟，包括序列類型婉宰、注釋類型并設(shè)置參數(shù)信息等。

GeSeq主要依靠同源注釋推穷，將你上傳的基因組序列和參考基因組序列作比對心包，來確定你的基因組中的結(jié)構(gòu)區(qū)。同源比對的方法有blast和hmmer兩種馒铃，參考基因組很近緣的情況下蟹腾，blast足夠使用了。

blast和hmmer既能注釋蛋白編碼區(qū)(cds區(qū))区宇，也能注釋非編碼RNA區(qū)(tRNA娃殖、rRNA)。蛋白編碼cds區(qū)目前只能通過同源注釋獲得议谷。對于非編碼RNA區(qū)炉爆，除了同源比對，GeSeq還提供了3種從頭預(yù)測非編碼RNA的方法卧晓，其實(shí)就是調(diào)用3種非編碼RNA預(yù)測軟件來實(shí)現(xiàn)芬首。如果同源比對未能找到全部的非編碼RNA，那么就可以通過這3種方法來嘗試獲取逼裆。

正常情況下郁稍，先將這3種方法關(guān)閉，若同源注釋缺少結(jié)果時再行開啟也不遲波附。有一點(diǎn)需注意，這3種方法之間相互獨(dú)立昼钻，和同源注釋方法也獨(dú)立掸屡，若開啟多種功能時，就會導(dǎo)致出現(xiàn)重復(fù)的RNA區(qū)域(因?yàn)楦鬈浖髯元?dú)立運(yùn)行獲得結(jié)果然评，GeSeq自己并不會去重)仅财，這時候還需手動在結(jié)果文件中刪除重復(fù)、冗余的結(jié)果碗淌。

中間部分盏求，導(dǎo)入?yún)⒖蓟蚪M序列(同種或近緣物種的葉綠體/線粒體基因組序列)抖锥。若想保證GeSeq正常運(yùn)行，這里必需要載入至少一個參考基因組碎罚。

GeSeq提供了在線導(dǎo)入和本地導(dǎo)入兩種方式磅废。 無論使用哪種，參考基因組肯定是越近緣越好荆烈，這樣就能保證準(zhǔn)確性和完整性拯勉； 否則結(jié)果中將會出現(xiàn)很多基因無法準(zhǔn)確注釋，主要體現(xiàn)在邊界區(qū)無法準(zhǔn)確確定憔购，覆蓋度不完全宫峦，長度過短，未得到有效的編碼氨基酸序列等(這時候你還需要手動去鑒定玫鸟，會很麻煩导绷，這也是很多測序公司不愿意接收缺乏近緣參考基因組的細(xì)胞器的注釋項(xiàng)目的原因，注釋繁瑣是一方面屎飘，有時候可能連基因組組裝都是問題)妥曲。

GeSeq和NCBI的數(shù)據(jù)庫相連的，所以一般來講我們輸入的參考基因組的NCBI登記號能夠很輕易找到并在線導(dǎo)入枚碗。

前面的選項(xiàng)設(shè)置好之后逾一，若無問題，右側(cè)點(diǎn)擊提交肮雨，等待一會兒即可出結(jié)果遵堵。注釋結(jié)果會在服務(wù)器中保存一段時間(時間不是長達(dá)幾周，或者你沒有手動刪除的話)怨规，期間若你瀏覽器關(guān)閉后再次打開GeSeq網(wǎng)站陌宿，會自動加載來的結(jié)果。

序列上傳注釋及結(jié)果說明

下面我們以某植物葉綠體基因組為例波丰，演示該網(wǎng)站的使用壳坪。該基因組以fasta格式存儲，文件名稱“test.fasta”掰烟，里面包含一條完整的環(huán)狀葉綠體序列爽蝴，序列id為contig1。(我這兒就不把這段序列上傳了纫骑，后面的步驟蝎亚，大家使用自己的序列模仿著來即可；若是覺得葉綠體注釋繁瑣先馆，可以換個動物線粒體嘗試)

對于該葉綠體序列发框，我們的參數(shù)設(shè)置如下。

最后提交煤墙，等待出結(jié)果梅惯。

點(diǎn)擊查看文件宪拥，在打開的文件中點(diǎn)擊“Download”可將結(jié)果下載到本地。

Genbank注釋結(jié)果文件铣减。

GFF注釋結(jié)果文件她君。

基因核酸序列fasta文件。

檢查結(jié)果的完整性徙歼，以及后續(xù)調(diào)整

是不是覺得注釋完成了犁河？不，我們還需檢查結(jié)果的完整性魄梯、可靠性桨螺。

GeSeq的結(jié)果文件需要后續(xù)調(diào)整后才能使用，不信你運(yùn)行一個后點(diǎn)開gff文件查看酿秸，里面的順序亂糟糟的灭翔，你得調(diào)整……不過這倒不是主要的問題，首先要查看的就是我們的基因組中辣苏，蛋白編碼基因和非編碼RNA區(qū)域是否有遺漏的肝箱，或者沒注釋完全的。

就我個人而言稀蟋，我習(xí)慣下載下來Genbank注釋文件后煌张，在Genbank文件中修改。因?yàn)镚enbank文件中的內(nèi)容全面退客，而且改好這一個后可以直接基于gbk文件再轉(zhuǎn)成gff文件骏融、基因核酸序列fasta文件、基因編碼氨基酸序列fasta文件萌狂、上傳NCBI用的tbl文件等档玻。這樣也就相當(dāng)于對其它的文件同時作修改了，就無須再單獨(dú)修改原始的gff茫藏、fasta文件之類的了误趴，快捷而高效。

我繼續(xù)舉一些經(jīng)驗(yàn)例子吧务傲。我習(xí)慣的做法凉当，打開參考基因組的gbk文件，以及GeSeq注釋得到的gbk售葡、文件看杭，兩者之間相互比較(眼睛看，嗯嗯天通，一定要仔細(xì)啊)泊窘，看自己的注釋結(jié)果和參考基因組的在哪里出現(xiàn)了不同熄驼。

備注：為了更方便比較像寒，推薦在基因組注釋前烘豹，將你的葉綠體基因組序列的起點(diǎn)調(diào)整為與參考基因組序列一致。(調(diào)整起點(diǎn)只對環(huán)狀序列適用)

一般來講诺祸，近源物種的葉綠體基因組還是非常保守的(無論種類還是堿基組成)携悯，所以大部分基因、RNA等位置都是一致的筷笨。對于不一致的區(qū)域憔鬼，根據(jù)注釋得到的基因(或RNA)名稱，看參考基因組中這段位置是否是這個基因胃夏，以及上下游的基因是否一致轴或。如果這兒缺少基因了，不妨重新調(diào)整參數(shù)注釋(比方說blast參數(shù)調(diào)寬松一些仰禀，開啟hmmer比對照雁，若有未得到的RNA，還可啟用從頭預(yù)測的方法)答恶；不行的話還需結(jié)合其它的細(xì)胞器注釋工具獲得(GeSeq網(wǎng)站中也列出了一系列可用的替代工具饺蚊，https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/Alternative-Tools.html)，或者手動查找悬嗓，比方說本地blast等污呼，雖然繁瑣但也是沒辦法的事情。若出現(xiàn)多出來的基因包竹，先看下這個基因的blast結(jié)果是否嚴(yán)謹(jǐn)燕酷，如果coverage也就40%的那種，那么基本就可斷定這條注釋是錯誤的映企，需要剔除悟狱。

經(jīng)常會出現(xiàn)相差一些堿基的情形，對于非編碼RNA還好說(這個只需找到核酸序列就行了)堰氓，相差幾個堿基也能說得過去挤渐；關(guān)鍵在于蛋白編碼基因區(qū)域的確定(這個還需給出完整的編碼氨基酸序列，需要明確起始双絮、終止密碼子的位置)浴麻，這個就嚴(yán)格了，相差幾個堿基就得不到有效的編碼產(chǎn)物囤攀。GeSeq注釋結(jié)果中软免，經(jīng)常會遇到這樣的情形。參考基因組與你的基因組親緣關(guān)系越遠(yuǎn)焚挠，就越容易出現(xiàn)未能注釋完全的基因結(jié)構(gòu)膏萧，如下示例就是其中情形之一。

那么，碰到這種情況時榛泛，怎么手動補(bǔ)全呢蝌蹂？我繼續(xù)分享經(jīng)驗(yàn)。

這個時候曹锨，我們就要根據(jù)參考基因組和自己基因組中這個基因的位置孤个，手動推測基因邊界，并作鑒定沛简。就以上圖為例吧齐鲤，參考基因組中，該基因“rpl16”的cds區(qū)所在區(qū)域?yàn)椤癹oin(182497..182505,183506..183904)”椒楣，長度為“9bp+399bp”给郊；我們的基因組中，得到的“rpl16”的cds區(qū)位于“183624..184022”捧灰，長度為“399bp”丑罪。這時候我們就很容易推測，GeSeq注釋時只注釋到了后面那一段cds區(qū)域凤壁，未能有效識別前一段cds以及內(nèi)含子結(jié)構(gòu)吩屹，很可能由于這段cds區(qū)長度過短所致。由于葉綠體基因組非常保守(至少近緣物種的是這樣拧抖，變異很小)煤搜，這就很有利于我們準(zhǔn)確推測前面那小段cds區(qū)的位置：對于后面那一段cds區(qū)，參考基因組中的位置為“183506..183904”唧席，我們的基因組中的位置為“183624..184022”擦盾，起始和終止位置“相差118bp”，即可知淌哟，前面小段cds區(qū)的“相差間隔”可能也是118bp迹卢，根據(jù)參考基因組中的位置“182497..182505”，推測其在我們的基因組中的位置“182615..182623”徒仓。

好了腐碱，這只是推測，怎么作驗(yàn)證呢掉弛？ 最簡單的方法就是把參考基因組中“join(182497..182505,183506..183904)”症见，以及我們的基因組中“join(182615..182623, 183624..184022)”這兩段序列截取下來，比較堿基組成是否一致殃饿。 samtools是個非常不錯的工具谋作，可以在這里用于截取fasta文件中特定位置的序列。

綜上乎芳，我們就明確了基因“rpl16”在我們的基因組中的準(zhǔn)確位置“join(182615..182623, 183624..184022)”遵蚜，然后在GeSeq注釋結(jié)果gbk文件中修改即可帖池。對于蛋白編碼的氨基酸序列，如果基因核酸序列組成和參考基因組一致吭净，這種情況下直接復(fù)制參考基因組該基因編碼的氨基酸序列就可以了(近緣物種葉綠體基因組非常保守碘裕，因此絕大多數(shù)情況下是一樣的)；如果有幾個堿基不一致攒钳，這時還得借助其它工具完成翻譯(基因組同源度不高時需要注意，這時候還可能產(chǎn)生提前終止等特殊的情形)雷滋。

好了不撑，上述展示了其中一種需要手動確定基因位置的情況，更多情況因篇幅原因就不再舉例了晤斩』烂剩總之記得，GeSeq的原始注釋結(jié)果一定要檢查的澳泵，可謂是小問題多多实愚。這個過程還是非常麻煩的，而且需要極大的耐心……最后兔辅，你得到了一個校正后的Genbank注釋文件腊敲，你確定無誤了后，就可以將它作個轉(zhuǎn)化了维苔。比如說轉(zhuǎn)成gff文件碰辅、fasta文件、tbl文件等介时，以用于后續(xù)特殊的需要没宾。這種情況下，只對的Genbank注釋文件作調(diào)整沸柔，然后再轉(zhuǎn)化得到其他文件還是蠻省事的循衰，這樣就不用再單獨(dú)對GeSeq注釋所得的原始gff等文件作調(diào)整了。

BioPerl褐澎、Biopython等工具包提供了這類的轉(zhuǎn)化腳本会钝，使用起來很方便，就不多提了工三。大不了使用前搜素一下“genbank轉(zhuǎn)tbl”之類的顽素，網(wǎng)上的方法多的很。

GeSeq的其它功能徒蟆，如基因組圈圖繪制

GeSeq網(wǎng)站中還提供了繪制細(xì)胞器基因組圈圖的界面胁出，GeSeq繪制的圈圖也非常的漂亮。

GeSeq基因組圈圖繪制界面：https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html

在該界面中段审，我們上傳一個葉綠體/線粒體基因組gbk文件全蝶，然后調(diào)整好作圖參數(shù)后，提交，等待一會兒便可得到圈圖結(jié)果抑淫。如下示例绷落。

示例圈圖結(jié)果如下，還挺好看的吧始苇。如果你也覺得這張圖挺漂亮的砌烁，那么倒也不必再費(fèi)時間額外使用circos、circlize催式、cgview等工具繪制基因組圈圖了函喉。

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