經(jīng)過預(yù)處理之后的數(shù)據(jù)历葛，就可以進(jìn)行差異分析了泪掀。對于甲基化芯片而言刃麸，有兩個方面的差異分析
DMP 差異甲基化探針
DMR 差異甲基化區(qū)域
在ChAMP包中靶衍，champ.DMP函數(shù)用于分析差異甲基化探針沦辙，champ.DMR函數(shù)用于分析差異甲基化區(qū)域夫植。本章我們先看下差異探針的分析
champ.DMP函數(shù)的用法示例
myDMP <- champ.DMP()
在差異分析時，我們需要兩個輸入數(shù)據(jù)油讯，一個就是探針的表達(dá)譜數(shù)據(jù)偷崩，beta ?matrix, 另外一個就是樣本的分組信息。
在champ.DMP函數(shù)中撞羽，默認(rèn)myNorm作為歸一化之后的beta ?matrix阐斜，對于樣本的分組信息，ChAMP默認(rèn)從Samplesheet.csv文件中讀取诀紊，在數(shù)據(jù)導(dǎo)入成功后谒出，myLoad$pd代表的就是SampleSheet.csv文件的信息，所以myLoad$pd$Sample_Group 代表樣本的分組信息邻奠。
在差異分析時笤喳，最關(guān)鍵的就是差異分組問題。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)階段碌宴，有很多類型的分組設(shè)計(jì)杀狡，比如最常見的case_vs_control, 兩個group的分組;多個組織，比如3個組織贰镣，共3個group; 時間序列呜象，比如藥物處理后的幾個時間點(diǎn)膳凝。不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，在差異分析時恭陡，想要關(guān)注的差異點(diǎn)自然不同蹬音，在分析時也要采取不同的分析策略。
對于ChAMP來說休玩，上述的幾種分組設(shè)計(jì)都是支持著淆。
champ.DMP計(jì)算過程分為以下3步：
1. 檢測樣本分組，確定分組比較
測試數(shù)據(jù)分成T和C兩組拴疤，每組各4個樣本永部、
在這一步，需要確定兩個因素：
分組的類型
主要識別分組變量是離散型還是連續(xù)型呐矾，如果是字符串型character, 就是離散型苔埋，如果是數(shù)值型numeric, 就是連續(xù)型。不同的類型凫佛，采取的差異分析策略不同讲坎。
測試數(shù)據(jù)是字符型的兩個group, 具體的輸入信息如下分組的個數(shù)
確定group的個數(shù)孕惜，2個group 肯定是兩者之間進(jìn)行差異分析愧薛，但是當(dāng)group 個數(shù)3個或以上時，就需要確定如何分組比較衫画。 默認(rèn)情況下兩兩之間都進(jìn)行差異分析毫炉，如果你不需要這么多的差異結(jié)果，可以通過compare.group參數(shù)指定削罩，compare.group參數(shù)的值是一個list, list 中的每個元素是一個長度為2的向量瞄勾，指定了用于差異分析的兩個group
[ Section 1: ?Check Input Pheno Start ]
?You pheno is character type.
? ?Your pheno information contains following groups. >>
? ?C:4 samples.
? ?T:4 samples.
? ?[The power of statistics analysis on groups contain very few samples may not strong.]
? ?pheno contains only 2 phenotypes
? ?compare.group parameter is NULL, two pheno types will be added into Compare List.
? ?C_to_T compare group : C, T
[ Section 1: ?Check Input Pheno Done ]
進(jìn)行差異探針分析
通過調(diào)用limma 函數(shù)進(jìn)行差異分析，默認(rèn)通過BH方法進(jìn)行多重建設(shè)檢驗(yàn)的校正弥激，p.adjust < 0.05 的認(rèn)為是差異探針
可以通過adjPVal參數(shù)修改p.adjust的閾值进陡，當(dāng)然也可以修改adjust.method 參數(shù)的值，調(diào)整多重假設(shè)檢驗(yàn)校正的算法微服，默認(rèn)值為BH, 可選值包括 “none”, “BH”, “BY”, “holm”趾疚。
[ Section 2: ?Find Differential Methylated CpGs Start ]
?Start to Compare : C, T
?Contrast Matrix
? ? ?Contrasts
Levels pT-pC
? ?pC ? ?-1
? ?pT ? ? 1
?You have found 4283 significant MVPs with a BH adjusted P-value below 0.05.
?Calculate DMP for C and T done.
[ Section 2: ?Find Numeric Vector Related CpGs Done ]
添加差異探針的注釋信息
之前的分析都是針對探針的beta matrix 進(jìn)行的分析，找的差異探針之后以蕴，我們肯定希望知道這個探針對應(yīng)的基因糙麦，染色體位置等注釋信息。這一步實(shí)際就是在已有的差異結(jié)果的基礎(chǔ)上丛肮，追加探針的注釋信息赡磅。
[ Section 3: ?Match Annotation Start ]
[ Section 3: ?Match Annotation Done ]
結(jié)果展示
str(myDMP)
List of 1
$ C_to_T:’data.frame’: ? ?4283 obs. of ?23 variables:
?..$ logFC ? ? ? ? ? ? ? ?: num [1:4283] 0.724 …
?..$ AveExpr ? ? ? ? ? ? ?: num [1:4283] 0.398 …
?..$ t ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?: num [1:4283] 28.2 …
?..$ P.Value ? ? ? ? ? ? ?: num [1:4283] 1.74e-08…
?..$ adj.P.Val ? ? ? ? ? ?: num [1:4283] 0.00703…
?..$ B ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?: num [1:4283] 7.6 7.05 …
?..$ C_AVG ? ? ? ? ? ? ? ?: num [1:4283] 0.0358 …
?..$ T_AVG ? ? ? ? ? ? ? ?: num [1:4283] 0.759 …
?..$ deltaBeta ? ? ? ? ? ?: num [1:4283] 0.724 …
?..$ CHR ? ? ? ? ? ? ? ? ?: Factor w/ 25 levels “”,”1”,”10”,”11”,..:?
?..$ MAPINFO ? ? ? ? ? ? ?: int [1:4283] 141516291 …
?..$ Strand ? ? ? ? ? ? ? : Factor w/ 3 levels “”,”F”,”R”: 3 2 …
?..$ Type ? ? ? ? ? ? ? ? : Factor w/ 2 levels “I”,”II”: 2 2 …
?..$ gene ? ? ? ? ? ? ? ? : Factor w/ 20622 levels “”,”A1BG” …
?..$ feature ? ? ? ? ? ? ?: chr [1:4283] “Body” “Body” …
?..$ cgi ? ? ? ? ? ? ? ? ?: Factor w/ 4 levels “island”,”opensea”,..: …
?..$ feat.cgi ? ? ? ? ? ? : Factor w/ 28 levels “1stExon-island”,..: 13 …
?..$ UCSC_CpG_Islands_Name: Factor w/ 27177 levels “”,”chr1:10003165-10003585”,..: 18278 …
?..$ DHS ? ? ? ? ? ? ? ? ?: logi [1:4283] NA NA NA NA NA NA …
?..$ Enhancer ? ? ? ? ? ? : logi [1:4283] TRUE TRUE NA NA NA NA …
?..$ Phantom ? ? ? ? ? ? ?: Factor w/ 11912 levels “”,”high-CpG:100009860- …
?..$ Probe_SNPs ? ? ? ? ? : Factor w/ 56004 levels “”,”rs10000615”,..:
?..$ Probe_SNPs_10 ? ? ? ?: Factor w/ 35790 levels “”,”rs10000804” …
myDMP 就是最終的差異分析結(jié)果，是一個list對象宝与，list中的每個元素是兩個group之間差異分析的結(jié)果焚廊。
測試數(shù)據(jù)只有兩個分組冶匹，所以list 中只有一個元素。差異分析的結(jié)果是一個data.frame對象节值，可以分成3個部分徙硅。
從logFC到B的部分是limma 差異輸出結(jié)果， C_AVG到deltaBeta是每組表達(dá)量的均值搞疗，deltaBate是兩組均值的差嗓蘑，CHR到Probe_SNPs_10是探針的注釋信息。
