題記：因為我們在準備煙草某些部位單細胞樣品的時候诬垂，質(zhì)量和活性總是比較低稚机，所以對于比較難制備的樣品，有的人推薦我們嘗試一下snRNA-seq侮繁。就去了解了一下snRNA-seq虑粥。
https://isbscience.org/about/what-is-systems-biology/
單細胞RNA測序（scRNA-seq）技術的飛速發(fā)展使人們對組織中細胞種類、細胞的特殊狀態(tài)有了深入認識宪哩。但是娩贷，scRNA-seq對于器官或者固體組織制備的細胞懸液的細胞活性和細胞數(shù)目有著較高的要求，這也意味著“躺在”超低溫冰箱中的大量珍貴樣本（腦組織锁孟，腫瘤組織等）都無法進行scRNA測序彬祖。而單細胞核RNA測序技術（snRNA-seq）的出現(xiàn)，則在很大程度上解決了以上問題品抽。
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雖然細胞核內(nèi)的遺傳物質(zhì)可以大體代表整個細胞储笑，然而，細胞質(zhì)和細胞核之間的RNA類型和比例卻存在一定的差異圆恤。RNA首先在細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄突倍，并在細胞核內(nèi)積累到穩(wěn)定狀態(tài)。在細胞質(zhì)中盆昙， mRNA根據(jù)其出核率和不同的命運羽历，包括轉(zhuǎn)運到特定的亞細胞位置、核糖體的翻譯淡喜、小RNA的降解等秕磷，達到不同的穩(wěn)態(tài)水平。研究人員發(fā)現(xiàn)炼团，細胞核RNA中含有大量的非編碼序列澎嚣，其中包含41%的基因間區(qū)序列和25%的內(nèi)含子序列。同時们镜，研究人員也發(fā)現(xiàn)有41.7%的轉(zhuǎn)錄本序列只在細胞核中存在币叹。多項研究表明，內(nèi)含子區(qū)域的reads增加了snRNA-seq的敏感性模狭，并提高識別細胞類型的分辨率颈抚。因此，在處理單細胞核RNA測序數(shù)據(jù)時，納入內(nèi)含子序列具有重要意義贩汉。
目前單細胞轉(zhuǎn)錄組測序驱富，還存在的主要缺陷：
應用范圍受限：僅適用于新鮮組織樣本，對于凍存樣本匹舞，由于細胞已經(jīng)喪失活性褐鸥，因此無法開展scRNA-seq。
細胞轉(zhuǎn)錄偏好：解離過程會誘導應激基因的表達赐稽，引發(fā)細胞轉(zhuǎn)錄模式發(fā)生“人為改變”（artifactual transcriptional stress responses）叫榕，造成轉(zhuǎn)錄偏好(bias)。這樣獲得的數(shù)據(jù)無法真實的反應樣本的細胞轉(zhuǎn)錄狀態(tài)姊舵，結(jié)果的可靠性大大降低晰绎。
細胞類型偏好：對于很多實體組織，如腦括丁、心臟荞下、腎臟等，蛋白酶傾向于將易于解離的細胞類型解離下來史飞，因此會丟失不易解離的細胞尖昏；同時一些較為敏感的細胞可能會因為解離過度而破碎。這樣构资，解離過程無法有效的獲取到組織中的所有細胞類型抽诉，結(jié)果的準確性大為降低。
例如蚯窥，在下面這個文章中作者發(fā)現(xiàn)“We could not detect expression of Fos and Socs3 in cryosections; however, we could detect Fosin SCs that had undergone dissociation, which demonstrated that the SCisolation procedure induces Fos expression in subpopulation of the SCs” 掸鹅。也就是說通過單細胞發(fā)現(xiàn)的有些marker基因可能并不是真正的塞帐，例如Fos等基因的表達量上調(diào)可能是解離過程引起的“人為偏差”拦赠。
下面這個研究利用snRNA-seq對小鼠纖維化腎臟細胞進行探索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)snRNA-seq在成人腎臟中實現(xiàn)了與scRNA-seq相似的基因檢測葵姥，而且它還有很多優(yōu)勢荷鼠，包括減少解離偏差，與冷凍樣本兼容榔幸，消除解離誘導的轉(zhuǎn)錄應激反應允乐，以及成功用于炎癥纖維化腎臟。
加州大學則成功的將snRNA-seq應用于人類凍存腦細胞組織樣本削咆。
而就植物單細胞研究而言牍疏，相比動物起步慢，也更困難拨齐。
植物細胞被固定在剛性細胞壁基質(zhì)中鳞陨，分離單細胞時需要將其移除；
植物細胞壁的酶消化是一種重要的脅迫源瞻惋，容易刺激植物細胞出現(xiàn)應激反應厦滤，誘導壓力應答基因的表達援岩，人為引入轉(zhuǎn)錄偏差；
植物原生質(zhì)體大小存在可變性（滲透壓導致的原生質(zhì)體脹大）掏导；
質(zhì)體細胞器享怀、和液泡中存在可與RNA相互作用的次級代謝物；
不同組織類型間適用的酶組合不同趟咆，需要優(yōu)化消化細胞壁所需的酶添瓷；
制備的原生質(zhì)體很脆弱，活性波動大值纱。
所以現(xiàn)在很多人提出仰坦，植物開展單細胞核測序，可能可以較好地克服上述困難计雌。
最近發(fā)表的植物單細胞的文章悄晃，也越來越多的人采用了snRNA-seq。
莖尖分生組織和早期葉片原基具有復雜的細胞結(jié)構凿滤，該結(jié)構由嵌入不同組成的細胞壁中的異質(zhì)細胞組成妈橄。制備原生質(zhì)體，需要長時間的酶消化翁脆。異位激活和隨機基因的表達與原生質(zhì)體形成相關眷蚓。在這個研究中，為了評估原生質(zhì)體對基因表達的影響反番，他們試圖檢測擬南芥葉片和葉肉原生質(zhì)體中的基因表達沙热，并觀察到頻繁的異位激活。例如罢缸，WOX2未在葉子中表達篙贸。追蹤了10,000多個原生質(zhì)體，觀察到超過21％的原生質(zhì)體表達了WOX2枫疆。該觀察結(jié)果強烈暗示通過原生質(zhì)體化存在基因表達的異位隨機激活爵川。
所以，這個文章采用了細胞核提取的方法息楔，得到正常形態(tài)的番茄莖尖分生組織的細胞核寝贡，進行snRNA-seq 。經(jīng)過質(zhì)量控制和過濾值依，獲得了13377 個核圃泡，檢測到基因數(shù)為21402 。為了評估snRNA-seq數(shù)據(jù)的可重復性和敏感性愿险， 這個文章同時用番茄莖尖進行 Bulk RNA-seq 颇蜡。snRNA-seq檢測到的基因，有92.3% 可以通過Bulk RNA-seq 檢測到（FPKM > 1 ），表明snRNA-seq 具有較高的敏感性澡匪，snRNA-seq和Bulk RNA-seq 的相關性達到0.9 熔任，表明具有很高的重現(xiàn)性。后面的分析就和常規(guī)scRNA-seq的分析類似了唁情。
德國的團隊同樣的疑苔，在分析單細胞數(shù)據(jù)前，進行了獨立的bulk RNA-seq實驗來識別原生質(zhì)體分離（protoplast isolation甸鸟，PI）應答基因惦费，然后將它們從scRNA-seq分析中剔除。發(fā)現(xiàn)無論剔除PI應答基因前后抢韭，PI誘導的影響均存在薪贫。
以上數(shù)據(jù)體現(xiàn)了植物單細胞核測序的技術性能，與單細胞測序相比刻恭，細胞核測序在得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)的同時也讓研究者不再受困于原生質(zhì)體制備瞧省，能夠推動植物單細胞研究。但是我們可能還是會首選scRNA-seq鳍贾，畢竟snRNA-seq會丟失細胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)錄信息鞍匾。對于實在不理想組織，的可能會考慮采取snRNA-seq骑科。
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