1. Author
Paul Bieniasz試圖探尋宿主基因和途徑如何影響逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制逞刷，比如HIV-1蚜厉。Bieniasz和他的團(tuán)隊(duì)主要關(guān)注人類(lèi)和靈長(zhǎng)類(lèi)免疫缺陷病毒侦镇，致力于確定病毒基因和蛋白質(zhì)的功能资锰，并表征逆轉(zhuǎn)錄病毒模擬和操縱的宿主功能谆棱。他們還研究了從古代到現(xiàn)代宿主細(xì)胞對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的分子防御機(jī)制叶组。此外拯田，該團(tuán)隊(duì)正在努力開(kāi)發(fā)更有用的艾滋病病毒感染模型，以改進(jìn)對(duì)新形式治療和疫苗接種扶叉。
2. Background
2.1 體細(xì)胞突變（somatic mutation）
B細(xì)胞產(chǎn)生多樣化的抗體的機(jī)制主要有兩個(gè)勿锅。一個(gè)是重組激活基因（RAG）編碼的重組酶等主導(dǎo)的基因重排；另一個(gè)是胞苷脫氨酶（AID）等主導(dǎo)的體細(xì)胞高頻突變（SHM）枣氧。胞苷脫氨酶不光參與了體細(xì)胞的高頻突變溢十，同時(shí)也參與了抗體的類(lèi)別轉(zhuǎn)化，當(dāng)然體細(xì)胞的高頻突變發(fā)生在抗體的類(lèi)別轉(zhuǎn)化之后达吞。以抗體的類(lèi)別轉(zhuǎn)化（isotype switching）為例张弛，在Th細(xì)胞的信號(hào)刺激下，胚系基因的轉(zhuǎn)錄組就會(huì)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，生成的mRNA結(jié)合在靶基因上吞鸭，形成R-loop結(jié)構(gòu)（DNA-RNA-DNA）寺董。游離的單鏈被AID識(shí)別并發(fā)生催化，使C變成U刻剥。緊接著在UNG的作用下脫U并在APE1作用下切割形成缺口遮咖。此時(shí)R-loop中的mRNA游離，本來(lái)作為模板鏈的DNA鏈也被酶解造虏。機(jī)體以此方式造成了DNA的雙鏈斷裂御吞，使DNA的重拍以及基因高頻突變成為可能。VDJ區(qū)域的重拍也是這個(gè)原理漓藕。值得一提的是陶珠，輔助性T細(xì)胞更傾向于與親和力高的BCR結(jié)合，這樣使得這些B細(xì)胞更有可能增殖進(jìn)而獲得生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)享钞。
2.2 RBD抗體的分類(lèi)
SARS-CoV-2病毒的表面刺突蛋白（Spike）由三個(gè)相同的單體構(gòu)成三聚體揍诽。三個(gè)受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（RBD）位于每個(gè)刺突蛋白的尖端。一個(gè)RBD可以從刺突蛋白的 “向下（down）”位置翻轉(zhuǎn)到 “向上（up）”位置栗竖，從而暴露了一個(gè)稱(chēng)為受體結(jié)合基序（receptor-bindingmotif暑脆，RBM）的隱藏位點(diǎn)。RBM負(fù)責(zé)病毒與宿主細(xì)胞ACE2受體的初步結(jié)合划滋，起始病毒進(jìn)入細(xì)胞饵筑。RBD特異性單克隆抗體可以阻斷RBM—ACE2的相互作用埃篓，是ACE2的阻斷劑处坪。
根據(jù)RBD的位置（向上或者向下）可以將Spike蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)區(qū)分為不同的構(gòu)象。對(duì)應(yīng)地根據(jù)中和性抗體與RBD不同的表位識(shí)別與結(jié)合模式架专，可以將其劃分為4種（I, II, III, and IV）類(lèi)型同窘。Class I中和抗體只能夠結(jié)合“向上”的RBD；Class II中和抗體 及Class III 中和抗體可以識(shí)別"向上或者向下"的RBDs部脚。其中想邦，I類(lèi)及II類(lèi)中和抗體可以阻斷RBM與ACE2的結(jié)合，III類(lèi)中和抗體除了可以阻斷ACE2結(jié)合位點(diǎn)也可以與相鄰的RBD前聚體相互作用委刘。Class IV 中和抗體除可以結(jié)合RBD的保守區(qū)域(核心I區(qū)域）或者僅為“向上”的RBD(核心II區(qū)域）丧没。其中IV類(lèi)核心I區(qū)域依賴(lài)的中和抗體除對(duì)SARS-CoV-2及其變體和其他相關(guān)冠狀病毒具有廣泛的中和活性。
3. Methods
1. 單克隆抗體
2. SARS-CoV-2假病毒中和實(shí)驗(yàn)
4.抗抗體rVSV/SARS-CoV-2變種的選擇
5. rVSV/SARS-CoV-2中和試驗(yàn)
6. 序列分析
7. 親和力測(cè)定
8. 蛋白表達(dá)和純化
9. 冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析
10. X-射線(xiàn)結(jié)構(gòu)分析
空斑純化
1.? ? 將病毒原液在PBS中梯度稀釋10倍锡移，并將每次稀釋液300μl施加到在6孔板中鋪板的MDCK細(xì)胞呕童，30min
2.? ? 丟棄殘留的培養(yǎng)基并用PBS洗滌細(xì)胞2次。然后在細(xì)胞上加入2ml覆蓋培養(yǎng)基（DMEM+2%FBS+0.9%BactoTM瓊脂）淆珊，培養(yǎng)2-3天以觀(guān)察斑塊夺饲。
3.? ? 1 ml移液管尖端從頂部拾取一塊斑塊，然后在4°C下將斑塊重懸在1 ml PBS中16小時(shí)。
#這1 ml含有病毒的PBS將用作第一輪斑塊往声，第二次重復(fù)斑塊純化擂找。
4.? ? 對(duì)產(chǎn)生的病毒進(jìn)行測(cè)序，并在75 cm燒瓶中的MDCK細(xì)胞中繁殖以制備病毒原液浩销。
4. Results
作者團(tuán)隊(duì)選取了1072個(gè)確診為中度或者重度的康復(fù)患者的1個(gè)月和6個(gè)月的RBD中和抗體贯涎。并選取了6個(gè)代表性家族的14個(gè)抗體。在這些抗體中慢洋，Ⅱ類(lèi)抗體占據(jù)大多數(shù)柬采，同時(shí)作者團(tuán)隊(duì)還做了BLI來(lái)表征抗體與病毒的相互作用。值得一提的是且警，實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)利用能夠自主復(fù)制的嵌合皰疹性口炎病毒(VSV)來(lái)確定每種抗體的無(wú)法中和的變異株粉捻，即逃逸變異株。
就家族Ⅱ的IGHV3-53+ IGLV2-14而言斑芜，1個(gè)月誘導(dǎo)產(chǎn)生的C144抗體與6個(gè)月誘導(dǎo)的C051/C052相比肩刃，具有L455/F456/E484/F490/Q493/S494突變的變異株可以對(duì)C144產(chǎn)生逃逸；C051/C052則有所不同杏头，Q493R的突變體仍然可以被C051/C052中和但E484K的突變株產(chǎn)生了逃逸盈包，這個(gè)突變位點(diǎn)同樣可以逃逸C144。
另一組屬于家族Ⅱ的抗體——IGHV3-66+IGLV2-33而言醇王，一個(gè)月誘導(dǎo)產(chǎn)生的C143/C164與6個(gè)月產(chǎn)生C055相比呢燥，C143/C164擁有者弱中和能力，但是同之前的IGHV3-53+ IGLV2-14相比：①體細(xì)胞突變率（SHM）較高寓娩， C055的SHM更高叛氨。②IGHV3-53+IGLV2-14逃逸的E484K這個(gè)位點(diǎn)在這個(gè)群里中被有效的抑制了。但是G485K棘伴，F(xiàn)486S/V能夠有效的逃逸這個(gè)群體寞埠。
最后一個(gè)家族是IGHV1-69+IGLV9-49。其中C548是1個(gè)月誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體焊夸，C549為6個(gè)月誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體仁连。就SHM而言C548與胚系基因相比只有1個(gè)核苷酸的不同，C549也只有大概20個(gè)左右的不同阱穗。其次E484K與Q493R突變株可以對(duì)C548進(jìn)行逃逸饭冬。而這種逃逸在C549中也存在，但程度有所減弱揪阶。值得一提的是實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)SHM使得突變株對(duì)C549的逃逸格外困難昌抠，需要擁有兩個(gè)以上的突變位點(diǎn)，例如Y449H/E484K與F486L/F490P遣钳。
RBDⅠ家族抗體中IGHV353/IGLV3-20編碼的抗體也存在差異——1個(gè)月誘導(dǎo)產(chǎn)生的C098與6個(gè)月誘導(dǎo)產(chǎn)生的C099扰魂。C099對(duì)變異株的親和力高于C098麦乞，并且C099而言，D420Y/N460H與L455R/Y453H的雙突變可以有效的逃逸C099的中和作用劝评。同理RBDⅢ家族抗體中IGHV4-4/IHLV2-14編碼的C132與C512也有明顯的差異姐直。C512對(duì)WT和R346S 變異株有著良好的親和力。但是被R346, K444, 或 G446逃逸蒋畜。有趣的是声畏，盡管C132的效力很差，但是可以親和K444姻成，被R346逃逸插龄。C512則被K444逃逸但親和R346。
上述的目光聚焦在抗體上科展，緊接著作者以B1.351均牢，即β株（突變位點(diǎn)為：E484K K417N N501Y）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，進(jìn)行了研究才睹。RBDⅡ家族的抗體全部被β株逃逸徘跪，但是經(jīng)過(guò)SHM之后的抗體C055、C549與毒株的親和力有所上升琅攘。RBDⅠ與Ⅲ的抗體不被β株影響垮庐，依舊擁有較高的親和力。除了β變異株意坞琴，SARS-CoV-2引發(fā)的抗體成熟可產(chǎn)生對(duì)抗其他sarcov病毒的活性哨查。
作者團(tuán)隊(duì)通過(guò)解析SARS-CoV-2-
Spike與結(jié)1類(lèi)(C098/C099)和2類(lèi)(C144/C051)抗體Fab片段的結(jié)構(gòu)，說(shuō)明了體細(xì)胞突變對(duì)抗體抗原相互作用的影響剧辐。在這些結(jié)構(gòu)中寒亥，感染后6.2個(gè)月發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)突變發(fā)生在互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)環(huán)。以shape complementarity（SC）指數(shù)來(lái)評(píng)估（其變化范圍從不匹配0到完美匹配1）浙于，SC指數(shù)在0.64-0.68护盈。
Ⅰ類(lèi)抗體：對(duì)于C098和C099挟纱，大多數(shù)RBD接觸是由CDR1和CDR2 V基因編碼區(qū)域介導(dǎo)的羞酗。099的CDRH1和CDRH2的體細(xì)胞突變促進(jìn)了結(jié)合和中和特性。例如紊服，在C099中發(fā)現(xiàn)的F27I突變引入了一個(gè)更小的疏水殘基檀轨，這可能使CDRH1環(huán)更靈活，促進(jìn)了該區(qū)域的極性接觸和范德華相互作用欺嗤。在CDRH2中参萄， S53A和Y58F去除了RBD界面上的極性接觸。Y58F被認(rèn)為在增加結(jié)合中起到了至關(guān)重要的作用煎饼。
Ⅱ類(lèi)抗體：與C144一樣讹挎，C051抗體重鏈介導(dǎo)了大部分RBD作用。RBD位點(diǎn)L455、F456筒溃、E484和Q493的突變能夠脫離C144马篮，而只有E484K突變能夠脫離C051。病毒在RBD位置L455和Q493的逃逸是由精氨酸執(zhí)行的怜奖，因?yàn)榫彼岬娜〈鷷?huì)破壞C144-RBD界面上的氫鍵浑测。此外，C051的CDRH3 E97D體細(xì)胞突變引入了一個(gè)較小的荷電殘基歪玲，可能更好地適應(yīng)該區(qū)域的精氨酸側(cè)鏈迁央。
緊接著作者團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步去分析2/3類(lèi)RBD抗體的逃逸機(jī)制：
①C548是由VH1-69 VH基因片段編碼的，該片段編碼CDRH2末端的疏水序列滥崩，該序列已被證明可以促進(jìn)對(duì)流感岖圈、丙型肝炎和HIV-1的廣泛中和作用。C548 殘基I53-F54靶向N343附近的RBD核心中的疏水中心钙皮，包括RBD殘基W436幅狮、N440和L441。C549之所以能夠避免逃逸是因?yàn)檩p鏈的體細(xì)胞高頻突變：30Y與RBB的殘基F490形成反作用株灸，而27D和92E則分別增加了與RBD側(cè)鏈N450和主鏈F449的極性接觸崇摄。
②C032識(shí)別一個(gè)糖肽表位，該表位集中在RBD核心的一個(gè)短螺旋段上慌烧，該螺旋段位于N343 -聚糖附近的437 – 442殘基上逐抑。在CDRH3末端，疏水殘基HC A97屹蚊、HC V98和HC W100被埋進(jìn)由344-348和443-450殘基組成的RBD環(huán)形成的口袋中厕氨。
③C080中的大部分體細(xì)胞突變位于Fab-RBD界面的遠(yuǎn)端。C080體細(xì)胞突變可能會(huì)影響抗原界面和CDR環(huán)構(gòu)象和靈活性汹粤。C080體細(xì)胞突變HC I31和LC F33分別與RBD殘基444-445和346直接相互作用命斧，預(yù)計(jì)CDRL3突變可間接促進(jìn)SARS-CoV RBD的識(shí)別。
5. Discussion
作者：Paul D.Bieniasz?? 單位：TheRockefeller University???
年份：2021.8.10??期刊：Cell immunity
科學(xué)問(wèn)題：隨著時(shí)間的推移嘱兼，體細(xì)胞高頻突變是否可以影響抗體的效力與廣譜程度
結(jié)論：通常国葬，在6.2個(gè)月時(shí)分離出的抗體比在1.3個(gè)月時(shí)分離出的克隆親屬的效力更高。一個(gè)例外是C144芹壕。結(jié)構(gòu)分析表明汇四，C144的高效與它將S三聚體鎖定在預(yù)融合封閉狀態(tài)的能力有關(guān)。與1.3個(gè)月的抗體相比踢涌，被選擇的突變具有對(duì)6.2個(gè)月抗體的抗性通孽。一些6.2個(gè)月抗體的顯著特征包括限制病毒逃逸的選擇范圍，以及在面對(duì)1.3個(gè)月抗體逃逸的點(diǎn)突變時(shí)保持中和活性睁壁。在某些情況下背苦，rVSV/SARS-CoV-2的選擇實(shí)驗(yàn)表明互捌，體細(xì)胞突變提高了抗體抗性的遺傳屏障，要求至少進(jìn)行2次替換才能避免中和行剂。RBD三突變體K417N/E484K/ N501Y通常不會(huì)對(duì)尚未受E484K突變影響的抗體產(chǎn)生耐藥性疫剃。只有E484K突變會(huì)產(chǎn)生更普遍的2類(lèi)抗體抗性。包括一些成熟的抗體(如C051, C052)硼讽。
