代謝工程可以通過改變遺傳調(diào)控元器件的表達強度達到優(yōu)化代謝途徑的目的挚币，進而實現(xiàn)目的產(chǎn)物的高效合成输硝。遺傳調(diào)控元器件主要包括啟動子开瞭、核糖體結(jié)合位點录煤、終止子以及其他一些調(diào)控基因表達的元件捞稿。

啟動子的定義：

啟動子是指一段能使基因進行轉(zhuǎn)錄的DNA 序列又谋，包括核心啟動子區(qū) (?35 區(qū)、?10 區(qū)) 和調(diào)控區(qū)域娱局。在轉(zhuǎn)錄起始時彰亥，啟動子與RNA 聚合酶、調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)生相互作用衰齐， 進而控制基因轉(zhuǎn)錄的起始時間和程度^[1]任斋。

啟動子結(jié)構(gòu)

啟動子的類型：

按照其誘導的方式可以分為組成型和誘導型啟動子。
組成型啟動子(Constitutive promoter)具有強啟動耻涛、不需添加誘導劑废酷、可直接產(chǎn)生目的蛋白以及成本低等優(yōu)勢，常見的如P43抹缕、PHpaII澈蟆、Plaps及PamyQ；根據(jù)表達時期的不同卓研，又可分為指數(shù)階段趴俘、對數(shù)中期和早期平穩(wěn)階段、滯后對數(shù)和平穩(wěn)階段以及平穩(wěn)階段4 種類型奏赘。
誘導型啟動子（Inducible promoter）可在特定的時期調(diào)控異源蛋白的表達量寥闪，具有可控、快速磨淌、大量等特點橙垢，如Pgrac、Pspac伦糯、Pxyl等^[2]柜某。

組成型啟動子

1.1 組成型啟動子P43

原始文獻：
Wang PZ, Doi RH. Overlapping promoters transcribed by bacillus subtilis sigma 55 and sigma 37 RNA polymerase holoenzymes during growth and stationary phases. J Biol Chem. 1984 Jul 10;259(13):8619-25. PMID: 6330116.
應用文獻：

1. Zhou C, Ye B, Cheng S, Zhao L, Liu Y, Jiang J, Yan X. Promoter engineering enables overproduction of foreign proteins from a single copy expression cassette in Bacillus subtilis. Microb Cell Fact. 2019 Jun 14;18(1):111. doi: 10.1186/s12934-019-1159-0. PMID: 31200722; PMCID: PMC6570832.
2. Chen J, Gai Y, Fu G, Zhou W, Zhang D, Wen J. Enhanced extracellular production of α-amylase in Bacillus subtilis by optimization of regulatory elements and over-expression of PrsA lipoprotein. Biotechnol Lett. 2015 Apr;37(4):899-906. doi: 10.1007/s10529-014-1755-3. Epub 2014 Dec 17. PMID: 25515799.

啟動子特征：可在對數(shù)生長期和穩(wěn)定期持續(xù)表達基因（logarithmic growth phase and stationary phase）
序列信息：K02174.1，B.subtilis P43 fragment containing two overlapping promoters
可選擇載體：pP43NMK敛纲、pUBC19

組成型啟動子P43

pP43NMK

pUBC19

1.2 組成型啟動子PHpaII

原始文獻：
Zyprian E, Matzura H. Characterization of signals promoting gene expression on the Staphylococcus aureus plasmid pUB110 and development of a gram-positive expression vector system. DNA. 1986 Jun;5(3):219-25. doi: 10.1089/dna.1986.5.219. PMID: 3013549.
啟動子特征：
可選擇載體：pMA5
序列信息：

ggtggagattttttgagtgatcttctcaaaaaatactacctgtcccttgctgatttttaaacgagcacgagagcaaaacccccctttgctgaggtggcagagggcaggtttttttgtttcttttttctcgtaaaaaaaagaaaggtcttaaaggttttatggttttggtcggcactgccgacagcctcgcagagcacacactttatgaatataaagtatagtgtgttatactttacttggaagtggttgccggaaagagcgaaaatgcctcacatttgtgccacctaaaaaggagcgattta

1.3 組成型啟動子Pylb

原始文獻：
Yu X, Xu J, Liu X, Chu X, Wang P, Tian J, Wu N, Fan Y. Identification of a highly efficient stationary phase promoter in Bacillus subtilis. Sci Rep. 2015 Dec 17;5:18405. doi: 10.1038/srep18405. PMID: 26673679; PMCID: PMC4682092.
應用文獻：

1. Zhou C, Ye B, Cheng S, Zhao L, Liu Y, Jiang J, Yan X. Promoter engineering enables overproduction of foreign proteins from a single copy expression cassette in Bacillus subtilis. Microb Cell Fact. 2019 Jun 14;18(1):111. doi: 10.1186/s12934-019-1159-0. PMID: 31200722; PMCID: PMC6570832.

啟動子特征：平穩(wěn)階段喂击，效果優(yōu)于P43
可選擇載體：根據(jù)pUBC19改造
序列信息：

Pylb(F4 strain)
ACTTCTCAAAGATCCCATGTGCTTAAAATTAAAGTTTAAATATTGGATTTTTTAAATAAAGCGTTTACAATATATGTAGAAACAACAAAGGGGGAGATTTGTTTGACAAAGGTAGAACGT

升級進化版本，升級編號NBP3510
原始文獻：
Promoter engineering enablesoverproduction of foreign proteins from a single copy expression cassette in Bacillus subtilis

1.4 組成型啟動子PsrfA

原始文獻：
Guan C, Cui W, Cheng J, Zhou L, Guo J, Hu X, Xiao G, Zhou Z. Construction and development of an auto-regulatory gene expression system in Bacillus subtilis. Microb Cell Fact. 2015 Sep 21;14:150. doi: 10.1186/s12934-015-0341-2. PMID: 26392346; PMCID: PMC4578258.
應用文獻：

1. Zhou C, Ye B, Cheng S, Zhao L, Liu Y, Jiang J, Yan X. Promoter engineering enables overproduction of foreign proteins from a single copy expression cassette in Bacillus subtilis. Microb Cell Fact. 2019 Jun 14;18(1):111. doi: 10.1186/s12934-019-1159-0. PMID: 31200722; PMCID: PMC6570832.
   特征：stationary phase promoter

誘導型啟動子

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2.1 誘導型啟動子Pgrac

文獻出處：Phan TT, Nguyen HD, Schumann W. Development of a strong intracellular expression system for Bacillus subtilis by optimizing promoter elements. J Biotechnol. 2012 Jan;157(1):167-72. doi: 10.1016/j.jbiotec.2011.10.006. Epub 2011 Nov 10. PMID: 22100269.

啟動子特征：通過融合groESL操縱子的強啟動子和lac操縱子淤翔，產(chǎn)生Pgrac啟動子翰绊，并構(gòu)建了新的表達系統(tǒng)載體。
可選擇載體：文中還構(gòu)建了新的表達載體，pHT106监嗜、pHT104谐檀、pHT205、pHT100……這些載體就是整合了優(yōu)化后的Pgrac啟動子元件裁奇。
序列信息：

AAAATTTTTTATCTTATCACTTGAAATTGGAAGGGAGATTCTTTATTATAAGAATTGTGG

Genetic features of the Pgrac promoter fused to the reporter gene bgaB.

2.2 誘導型啟動子Pgrac100

文獻出處：Phan TT, Tran LT, Schumann W, Nguyen HD. Development of Pgrac100-based expression vectors allowing high protein production levels in Bacillus subtilis and relatively low basal expression in Escherichia coli. Microb Cell Fact. 2015 May 21;14:72. doi: 10.1186/s12934-015-0255-z. PMID: 25990516; PMCID: PMC4446860.

啟動子特征：在枯草芽孢桿菌確定合適的誘導型啟動子控制重組蛋白表達桐猬，同時在沒有誘導物的情況下在大腸桿菌中保持相對低的表達水平，是構(gòu)建枯草芽孢桿菌表達載體的重要要求刽肠。通過啟動子文庫篩選（Pgrac-promoter library）溃肪，作者篩選到滿足上述兩點要求的啟動子 Pgrac100。
可選擇載體：建了可供使用的表達載體音五。其中包括pHT253 (His-tag-MCS), pHT254 (MCS-His-tag) 和 pHT255 (MCS-Strep-tag)
序列信息：

AAAATTTTTTAAAAAATCTCTTGACATTGGAAGGGAGATATGTTATTATAAGAATTGCGG

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2.3 誘導型啟動子PxylA

文獻出處：
Rygus T, Scheler A, Allmansberger R, Hillen W. Molecular cloning, structure, promoters and regulatory elements for transcription of the Bacillus megaterium encoded regulon for xylose utilization. Arch Microbiol. 1991;155(6):535-42. doi: 10.1007/BF00245346. PMID: 1719948.

應用文獻：

1. Development of a new integration site within the Bacillus subtilis chromosome and construction of compatible expression cassettes
2. Bhavsar AP, Zhao X, Brown ED. Development and characterization of a xylose-dependent system for expression of cloned genes in Bacillus subtilis: conditional complementation of a teichoic acid mutant. Appl Environ Microbiol. 2001 Jan;67(1):403-10. doi: 10.1128/AEM.67.1.403-410.2001. Erratum in: Appl Environ Microbiol 2001 Nov;67(11):5349. PMID: 11133472; PMCID: PMC92592.

3. Promoter engineering enables overproduction of foreign proteins from a single
   copy expression cassette in Bacillus subtilis

   
   
   image.png
   
   

   啟動子特征：木糖誘導
   可用載體：pAX01

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pX載體中PxylA序列

優(yōu)化啟動子
文獻：Development of an Inducible Secretory Expression System in Bacillus licheniformis Based on an Engineered Xylose Operon
木糖啟動子對大部分代謝產(chǎn)物不敏感,受葡萄糖的抑制惫撰。

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2.4 誘導型啟動子Pspac

原始文獻：
Yansura DG, Henner DJ. Use of the Escherichia coli lac repressor and operator to control gene expression in Bacillus subtilis. Proc Natl Acad Sci U S A. 1984 Jan;81(2):439-43. doi: 10.1073/pnas.81.2.439. PMID: 6420789; PMCID: PMC344692.
應用文獻：
Development and characterization of a xylose-dependent system for expression of cloned genes in Bacillus subtilis: conditional complementation of a teichoic acid mutant

2.5 誘導型啟動子Para

原始文獻：
S-Nogueira I, Nogueira TV, Soares S, de Lencastre H. The Bacillus subtilis L-arabinose (ara) operon: nucleotide sequence, genetic organization and expression. Microbiology (Reading). 1997 Mar;143 ( Pt 3):957-969. doi: 10.1099/00221287-143-3-957. PMID: 9084180.
應用文獻：
Introduction of marker-free deletions in Bacillus subtilis using the AraR repressor and the ara promoter

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其他誘導型啟動子

1. 蔗糖啟動子PsacB：啟動子的轉(zhuǎn)錄不受蔗糖的嚴格調(diào)控，在沒有誘導劑時也能進行轉(zhuǎn)錄躺涝，但較有蔗糖誘導時強度低100倍厨钻。
2. 麥芽糖誘導型啟動子Pglv：glv啟動子以麥芽糖為誘導物，價格便宜坚嗜，工業(yè)成本低莉撇，安全無毒，使用價值比較大惶傻。但是發(fā)酵中產(chǎn)生的葡萄糖會對啟動子有強烈的反饋抑制,這是工業(yè)應用上面急需解決的一個問題棍郎。

啟動子的預測

啟動子的預測軟件有Cpgplot、CpGPrediction银室、EMBOSS涂佃、NNPP、Promoter2.0蜈敢、Promoter Scan等辜荠。

參考文獻：
常見的真核和原核表達系統(tǒng)的啟動子（promoters）

1. 枯草芽孢桿菌代謝工程改造的策略與工具 ?

2. 雙啟動子促進亮氨酸脫氫酶在Bacillus subtilis中表達及發(fā)酵研究 ?