Tips for arabidopsis transformation
擬南芥是一個神奇的模式生物，原因很多誊垢，其中最重要的是易于轉化客冈。產生轉基因的動機有很多戳杀。擬南芥，從研究活植物中基因和蛋白質的轉錄和翻譯動態(tài)虏杰，到補充突變表型仲闽。擬南芥適用于花滴或浸提轉化法。
這種方法的一般步驟包括：
質粒的克隆與轉化根癌農桿菌-一種將dna(Tdna)穩(wěn)定整合到其攻擊的植物基因組中的植物致病性物種宴卖。
轉化農桿菌培養(yǎng)
在農桿菌培養(yǎng)中浸泡你的植物的花，以便將tDNA插入到植物的胚芽中
選擇有tdna插入的種子(通常通過種子生長在含抗生素的培養(yǎng)基上)
性質上也有類似的過程邻悬；農桿菌TDNA插入可能促使甘薯馴化(肯特等人, 2015)!這聽起來很簡單症昏，而且很簡單，但是有一些技巧和技巧可以用來獲得最佳的轉換效率拘悦。它可能需要6-8周，從轉化日期到有一個可分析的轉基因手橱脸，所以這是非常重要的是础米，使這一過程是正確的，第一次添诉。我會在這里列出一些指導方針屁桑。一個詳細的轉換協(xié)議，以及用于增長的協(xié)議栏赴。擬南芥也可獲得(Weigel和Glazebrook蘑斧，2002年).
選擇表達系統(tǒng)
選擇合適的表達載體是構建轉基因擬南芥的第一步。有很多很好的選擇须眷，但這里有幾個我最喜歡的選擇竖瘾。中川津司實驗室的質粒是二進制網(wǎng)關向量并可用于啟動子與熒光蛋白(YFP、GFP花颗、CFP捕传、RFP等)的啟動子交換和N、C末端標記融合蛋白的生成扩劝∮孤郏或關聯(lián)標記(HA、標志)棒呛。此外聂示，還有多種植物選擇標記(BASTA、濕霉素簇秒、卡那霉素鱼喉、衣霉素)。中川等人, 2007)∑研祝或者气筋，如果你愿意金門總成，有一系列的丁尼實驗室的質粒這還允許根據(jù)RFP在種子中的表達對轉化子進行可視化選擇(Emami旋圆，Yee和Dinneny宠默，2013年).
植物轉化準備
無論你正在轉化成什么植物，都將是你的T0代灵巧。當這些植物開始開花時搀矫，它們就可以轉化了。在花期開始后不久進行轉化是很重要的刻肄。如果你的植物開始開花之前瓤球，你的構造準備轉化，你可以切斷初級花序(植物的開花部分)附近的莖基部敏弃。這給你買了幾天卦羡，直到新的花序開始增長。這也將增加花序總數(shù)麦到，這可能提高轉化效率绿饵。如果你看到許多成熟的角果(種子莢)，你的植物可能太老瓶颠，無法轉化拟赊。這種轉換仍然有效，但效率將很低粹淋。
小貼士：
使用健康的植物：你的植物不應該表現(xiàn)出壓力的跡象吸祟，如花青素的產生，或疾病桃移，如真菌的生長屋匕。健康的植物產生大量的種子。更多的種子意味著更多的機會來恢復一個轉型借杰。
使用年輕的植物：如果你早早地轉化炒瘟，你的植物在你把花暴露在花叢中之后，還會有足夠的時間生產種子第步。農桿菌疮装。更多的種子意味著更多的機會來恢復一個轉型。
使用大量的植物：許多植物產生大量的種子粘都。我通常使用8-10個植物的每一個構造我轉換廓推。更多的種子意味著更多的機會來恢復一個轉型。
在轉化前去掉成熟的角質：在轉化前成熟的纖毛蟲充滿了你知道不會攜帶轉基因的種子翩隧。您可以選擇刪除它們樊展，以減少您以后要從池中選擇的未轉換種子的數(shù)量。
這個擬南芥轉化過程
這個過程本身很簡單。當你的農業(yè)細菌培養(yǎng)做好準備后专缠，將它們向下旋轉雷酪，并將它們重新懸掛在轉化介質中。如果你在浸泡你的植物涝婉，把培養(yǎng)放進一個足夠寬的容器里哥力，把你的植物的花浸在里面。50毫升的獵鷹管或塑料稱重船都是很好的選擇墩弯，這取決于你選擇使用的養(yǎng)殖量吩跋。你會得到農桿菌整個手套，所以一定要更換手套之間的結構渔工，如果您正在轉換多個結構在一次锌钮。
有關詳細協(xié)議、體積引矩、自旋速度梁丘、配方和農桿菌菌株見Weigel和Glazebrook，2002年.
小貼士：
做菌落PCR你的農桿菌：得到一個轉化需要很長的時間旺韭。確保你正在培養(yǎng)的農用細菌一定含有你的質粒氛谜。
長出許多農桿菌：：你接觸到的農桿菌越多，你就越有可能得到一種轉化劑茂翔。我喜歡把100 mL的培養(yǎng)物降下來混蔼，然后再懸浮在25 mL的轉化培養(yǎng)基中履腋。農桿菌應變珊燎。此外，轉換過程可能會變得有點混亂遵湖，所以您需要確保您有足夠的體積來浸您所有的植物悔政。
確保你的農桿菌文化并沒有過度飽和：農桿菌需要活著才能感染你的植物。如果你的培養(yǎng)物在靜止期被孵化了太長時間延旧，你的培養(yǎng)中的細胞將不再是可行的谋国。這將需要的時間將取決于您正在使用的培養(yǎng)量，以及您是從冷凍砧木或菌落從LB板接種迁沫。在我的手中芦瘾，接種在平板上的菌落的5mL發(fā)酵劑培養(yǎng)將在18-24小時內達到最佳密度。然后集畅，我在100 mL新鮮培養(yǎng)基中加入0.5 mL這種發(fā)酵劑近弟，然后再用24小時進行轉化。剩余的發(fā)酵劑可用于菌落PCR和甘油砧木挺智。
浸泡/滴灌植物不止一次：浸泡你的植物祷愉，讓它們恢復一周，然后再浸泡它們。這不會傷害他們二鳄，也會增加tDNA整合的機會赴涵。
選材擬南芥轉化
一旦你的種子從你的T0植物是干燥的，是時候選擇轉化订讼。從每一次轉化中選擇多個T1植株是非常重要的髓窜。我喜歡隔離至少五個人。您無法控制發(fā)生了多少次插入躯嫉。有太多的插入會導致過度表達的工件纱烘，這樣的結構很可能會在以后的幾代中被沉默。您將知道祈餐，如果您獲得了一個轉換單插入擂啥，因為它將分離3：1在T2代。您也無法控制您的構造將被插入的位置帆阳。如果您的插入發(fā)生在編碼區(qū)域哺壶，它可能會導致意外的表型。對于大多數(shù)表型分析蜒谤，開始在T2代工作是合適的山宾。選擇過程本身會影響抗病植物的生長，所以你會想知道在沒有選擇的情況下插入的效果鳍徽。
有關抗生素選擇的協(xié)議资锰，請查看哈里森等人, 2006.
小貼士：
在選擇過程中不要過于密集地制種：這將增加非轉化者的背景生長，并使尋找真正的轉化者更加困難阶祭。
不要把你的植物放在選擇板上太久：即使是抗性植物最終也會受到選擇的影響绷杜。
基因型假定的T1轉化人：當你的T1在土壤上，并已從選擇的壓力恢復濒募，你可以剪輯一片葉子鞭盟，并提取基因組DNA進行基因分型。這不會傷害你的植物瑰剃，在T1比T2更容易基因型齿诉。你的轉基因不應該分離在T1，但它可能會在T2晌姚。
References
1. Emami, S., Yee, M. and Dinneny, J. R. (2013) ‘A robust family of Golden Gate Agrobacterium vectors for plant synthetic biology’,?Frontiers in Plant Science, 4. doi: 10.3389/fpls.2013.00339. PubMed?PMID:?24032037. PubMed Central?PMCID: PMC3759027.
2 Harrison, S. J.?et al.?(2006) ‘A rapid and robust method of identifying transformed Arabidopsis thaliana seedlings following floral dip transformation’,?Plant Methods. BioMed Central, 2(1), p. 19. doi: 10.1186/1746-4811-2-19. PubMed?PMID: 17087829. PubMed Central?PMCID: PMC1636043.
3. Kyndt, T.?et al.?(2015) ‘The genome of cultivated sweet potato contains Agrobacterium T-DNAs with expressed genes: An example of a naturally transgenic food crop.’,?Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. National Academy of Sciences, 112(18), pp. 5844–9. doi: 10.1073/pnas.1419685112. PubMed?PMID: 25902487. PubMed Central?PMCID: PMC4426443.
4. Nakagawa, T.?et al.?(2007) ‘Improved Gateway Binary Vectors: High-Performance Vectors for Creation of Fusion Constructs in Transgenic Analysis of Plants’,?Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 71(8), pp. 2095–2100. doi: 10.1271/bbb.70216. PubMed?PMID: 17690442.
5. Weigel, D. and Glazebrook, J. (2002)?Arabidopsis : a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Available at:?https://books.google.at/books/about/Arabidopsis.html?id=IfZAMNPWVk4C&redir_esc=y?(Accessed: 21 September 2018).
Additional resources on the Addgene blog
Engineering the plant genome using CRISPR/Cas9
Using?pSiM24 for simplifying plant genetic engineering
Using arabidopsis in the classroom
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