史晏榕, 孫宇輝
摘要: DNA克隆和組裝技術是重要的分子生物學工具旬薯。近年來效诅，隨著合成生物學的飛速發(fā)展布隔，對大片段DNA元件的快速有效組裝就顯得尤為關鍵梧乘。同時澎迎，各種DNA克隆和組裝技術也競相發(fā)展起來。通過對基于非典型酶切連接选调、PCR夹供、同源重組、單鏈退火拼接等原理發(fā)展起來的各種DNA克隆和組裝技術進行綜述仁堪，為合成生物學的進一步發(fā)展提供有效的操作工具哮洽。
關鍵詞: DNA克隆和組裝 非典型酶切連接 PCR 同源重組 單鏈退火拼接
Progress in DNA cloning and assembly techniques
SHI Yan-Rong, SUN Yu-Hui
Abstract: DNA cloning and assembly techniques are essential tools for molecular biology research. With the recent advances in synthetic biology, efficient and fast assembly of large DNA including a number of genes is becoming more and more important. Meanwhile, a variety of DNA assembly methods are also developed very quickly. In this paper, various DNA assembly methods based on atypical enzyme digestion and ligation, PCR, homologous recombination, single strand annealing and splicing are summarized for providing effective technique tools for the further development of synthetic biology.
Key words: DNA cloning and assembly Atypical enzyme digestion and ligation PCR Homologous recombination Single strand annealing and splicing
DNA克隆和組裝技術是現(xiàn)代分子生物學的一項重要工具。近年來枝笨，隨著結構組學和蛋白組學的發(fā)展袁铐，特別是旨在應用工程學的研究思路及手段去設計改造基因揭蜒、生物元件、生物途徑剔桨，甚至整個基因組的合成生物學的迅速發(fā)展屉更，組裝DNA元件就顯的越來越重要。雖然傳統(tǒng)的利用II型限制性內切酶產生合適的DNA片段的酶切連接克隆策略仍然在發(fā)揮著重要作用洒缀，但是由于酶切位點有限瑰谜，這種方法在平行無縫克隆或多DNA片段組裝方面已顯現(xiàn)出其不足之處[1]。本文綜述了近年來根據(jù)非典型酶切連接树绩、PCR萨脑、同源重組、單鏈退火拼接等原理發(fā)展起來的各種DNA克隆和組裝技術饺饭，為合成生物學更加快速而高效地進行大片段DNA的克隆和組裝提供技術支持渤早。
1 非典型酶切連接技術
傳統(tǒng)的利用II型限制性內切酶的酶切連接克隆策略雖然仍然在分子生物學領域發(fā)揮著重要作用，但是由于可用的酶切位點有限瘫俊，其越來越難以滿足研究者通過多片段組裝來獲得大片段DNA的需要鹊杖。因此，迫切需要一些不受酶切位點限制的技術來解決這一問題扛芽。例如骂蓖，依賴于同尾酶的BioBrickTM技術和依賴于IIs型限制性內切酶的金門分子克隆技術(Golden gate cloning)技術。
1.1 依賴于同尾酶的BioBrickTM技術
同尾酶(如Xba I和Spe I川尖、Bgl II和BamH I等)是指一類能夠識別DNA分子中不同核苷酸序列登下，但能產生相同黏性末端的限制性內切酶。當酶切后的兩個片段相連時叮喳，原來的酶切位點將不復存在被芳，也就不能再被原有的限制性內切酶所識別，達到“焊死”狀態(tài)馍悟。
BioBrickTM技術最初由美國麻省理工學院的Knight研究組于2003年提出筐钟，它是通過在目的生物元件兩端設計前置序列和后置序列(即同尾酶)，然后利用這些同尾酶將這些不同的生物元件組合在一起產生新的有功能的元件[2](圖 1)赋朦。因此，BioBrickTM技術最大的優(yōu)勢就是能夠利用一對同尾酶實現(xiàn)多個DNA片段的組裝李破。當然宠哄，該法仍不能避免對DNA序列本身的依賴性，而且最主要的缺點是在元件連接處會留有額外新增的8 bp的“疤痕”嗤攻，而這段“疤痕”在某些情況下是不可接受的[3]毛嫉。
|
|
| 圖 1 BioBrickTM技術組裝流程Figure 1 BioBrickTM assembly |
|
|
利用BioBrickTM技術可以將一系列獨立的生物元件，包括啟動子妇菱、核糖體結合位點(RBS)承粤、開放閱讀框(ORF)及終止子等按照一定的順序組裝成一個有功能的基因或生物途徑[4]暴区。在2013年，韓國玄武大學的Sohng研究組就成功利用BioBrickTM技術將來自于環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)參與2-脫氧鏈霉胺(2-deoxystreptamine辛臊，2-DOS)生物合成的3個基因btrC (DOI合成酶基因)仙粱、btrS (氨基轉移酶基因)和btrN (脫氫酶基因)以及其相應的T7啟動子、lacO操縱子彻舰、RBS序列及T7終止子進行體外組裝伐割，并在大腸桿菌中成功實現(xiàn)了異源表達[5]。本研究組在慶大霉素(Gentamicin)等氨基糖苷類抗生素生物合成機制研究過程中[6]刃唤，通過BioBrickTM技術對參與慶大霉素前體生物合成所需基因genC (DOI合成酶基因)隔心、genS1 (氨基轉移酶基因)、genE (脫氫酶基因)尚胞、genM1 (糖基轉移酶基因)進行了定向拼接硬霍，并成功檢測到目標產物2-N-acetylparomamine。
1.2 依賴于IIs型限制性內切酶的Goldengate cloning技術
IIs型限制性內切酶(如Bsa I笼裳、Bbs I唯卖、BsmB I和Sap I等)是一類特殊的限制性內切酶，與分子生物學最常用的II型限制性內切酶(識別位點為回文對稱序列侍咱，切割位點與識別序列重疊)不同耐床，其識別位點是一個非回文對稱的序列，而切割位點位于識別位點的外側楔脯。因此撩轰，當被IIs型限制性內切酶酶切后的兩個片段相連時，原來的識別位點將不復存在昧廷，在后續(xù)的酶切連接反應中也就不會再次被切割堪嫂，也達到“焊死”的效果。
Golden gate cloning (圖 2)就是利用IIs型限制性內切酶的這一特性在這些酶的識別序列外側人為地設計切割位點不同的序列木柬，然后利用同一限制性內切酶產生不同的黏性末端皆串，從而一次性組裝多個片段[7]，克服了傳統(tǒng)多片段組裝中需要同時使用多個不同限制性內切酶的不足眉枕。相對于BioBrickTM技術而言恶复，該技術的最大特點是不會引入任何額外的“疤痕”，從而實現(xiàn)了DNA片段的無痕連接速挑，但缺點是仍然避免不了內切酶本質上對DNA識別序列的依賴性谤牡。
|
|
| 圖 2 Golden gate cloning技術組裝流程Figure 2 Golden gate cloning assembly |
|
|
2004年，美國加利福尼亞大學舊金山分校的Kodumal等就利用IIs型限制性內切酶Bsa I和Bbs I對紅霉素生物合成中6-脫氧紅霉內酯B (6-deoxyerythronolide B姥宝，6-DEB)的所有合成模塊進行堿基優(yōu)化和克隆翅萤，組裝成了一個連續(xù)的32 kb的聚酮合酶生物合成基因簇，并將其在大腸桿菌中成功異源表達[8]腊满。2013年套么，中國科學院上海生命科學研究院的趙國屏研究組又利用一種可識別甲基化序列mCNNR (R=A or G)的IIs型限制性內切酶MspJ I培己，發(fā)展了一種甲基化輔助末端連接(Methylation-assisted tailorable ends rational ligation，MASTER)方法胚泌，并利用該方法成功組裝完成了29 kb的天藍色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)放線紫紅素生物合成基因簇[9]省咨。
2 PCR技術
自從20世紀90年代PCR (Polymerase chain reaction)技術被用于基因合成以來，一系列依賴于PCR的DNA克隆和組裝技術也逐漸發(fā)展起來了诸迟。例如重疊延伸PCR (Overlap extension PCR茸炒，OE-PCR)和環(huán)形聚合酶延伸克隆(Circular polymerase extension cloning，CPEC)技術阵苇，這些技術都可以解決上述典型和非典型酶切連接對于序列依賴的問題壁公，達到無痕、非序列依賴性的效果绅项。
2.1 OE-PCR技術
又稱融合PCR紊册，它是利用兩個具有互補末端的引物，使兩段PCR產物末端產生重疊序列快耿，然后通過重疊序列變性退火形成互補雙鏈囊陡，在DNA聚合酶的作用下進行延伸，最后再利用兩端引物擴增產生完整的融合雙鏈DNA[10](圖 3)掀亥。該法操作簡單撞反， 周期短，已經廣泛應用于基因克隆搪花、定點突變和基因拼接等研究中[11]遏片，而且國內外許多公司已經將其商業(yè)化。例如Stratagene公司研制的QuickChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kits就是基于OE-PCR技術開發(fā)出來的進行基因定點突變的成熟試劑盒撮竿，并已經在許多研究工作中得到成功應用吮便。如本研究組在探索蘭卡殺菌素(Lankacidin)生物合成機制時，就利用該技術對可能參與其合成的兩個脫水酶LkcB和LkcC中的活性催化位點進行定點突變幢踏，從而證明該脫水酶活性對于蘭卡殺菌素的生物合成是必不可少的[12]髓需。
|
|
| 圖 3 重疊延伸PCR技術組裝流程Figure 3 OE-PCR assembly |
|
|
相對于上述的非典型酶切連接而言，OE-PCR技術除需要依賴目的DNA片段末端序列產生重疊區(qū)外房蝉，整個PCR反應不受序列的限制僚匆，而且能夠實現(xiàn)無痕連接，但卻避免不了對DNA聚合酶高保真度的依賴搭幻。隨著DNA片段長度的增加白热，PCR反應效率逐漸降低，引入錯誤的概率也逐漸升高粗卜，因此，難以通過該技術組裝較大的DNA片段纳击。
2.2 CPEC技術
與OE-PCR類似续扔，CPEC首先利用具有互補末端的引物攻臀，使線性雙鏈DNA片段和載體末端產生重疊序列，然后通過該具有末端重疊序列的線性雙鏈DNA片段和載體經過變性和退火得到具有重疊末端的單鏈產物纱昧，最后彼此互為模板和引物刨啸，在DNA聚合酶的作用下進行延伸得到環(huán)狀載體，得到的重組載體直接轉化大腸桿菌识脆，利用大腸桿菌體內的修復機制得到完整雙鏈環(huán)狀目的克隆[13](圖 4)设联。這種方法最大的優(yōu)勢就是僅依賴于DNA片段之間以及片段與載體之間的末端重疊序列就可以簡單高效地完成多個DNA片段的組裝。但是由于該方法也依賴于PCR灼捂，當序列高度重復或G+C含量較高時离例，就難以保證組裝的精確性。
|
|
| 圖 4 環(huán)形聚合酶延伸克隆技術組裝流程Figure 4 CPEC assembly |
|
|
3 同源重組技術
同源重組是指含有重疊序列的DNA分子之間或分子內部的重新組合悉稠，其已經廣泛應用于分子生物學研究中宫蛆。當操作較大的DNA分子時，DNA體外組裝就會變得較為困難的猛，這時就需要體內大片段DNA組裝方法耀盗，例如目前最常用的釀酒酵母體內的轉化耦聯(lián)重組技術(Transformation-associated recombination，TAR)和大腸桿菌體內的Red/Rec同源重組技術卦尊。
3.1 TAR技術
TAR是利用釀酒酵母體內高效的同源重組系統(tǒng)實現(xiàn)多個具有末端重疊序列的DNA片段的一步組裝方法[14](圖 5)叛拷。它不僅能夠方便地將較短的DNA片段組裝成較長的DNA片段[15]，甚至還能夠實現(xiàn)整個基因組的組裝岂却。
|
|
| 圖 5 TAR技術組裝流程Figure 5 TAR assembly |
|
|
早在2008年忿薇，美國J. CraigVenter研究所的Venter研究組就在釀酒酵母中通過該技術完成了生殖道支原體(Mycoplasma genitalium)基因組(582 970 bp)的最后一步組裝[16]。2009年淌友，他們又對其進行了改進煌恢，將25個具有末端重疊序列的片段(17?35 kb)及一個線性化的載體在釀酒酵母中直接組裝成一個攜帶該基因組的環(huán)形質粒[17]。同樣震庭，他們在2010年利用釀酒酵母同源重組系統(tǒng)完成了1 078條大小為1 080 bp的DNA片段的組裝瑰抵，最終人工合成了1.08 Mb的絲狀支原體(Mycoplasma mycoides)基因組[18]。
酵母體內的同源重組是到目前為止最高效的DNA大片段的組裝方法器联，在合成更長的DNA片段如基因組時有較大的優(yōu)勢二汛。同時，TAR克隆經過多年的發(fā)展拨拓、改進肴颊，已經成為一種成熟的技術，也已經應用到多個領域渣磷，但是它也有自身的不足婿着。例如，當克隆大于250 kb的DNA片段時，DNA斷裂將成為一個重要的限制因素竟宋；當克隆區(qū)域富含重復序列時提完，可能會在酵母有絲分裂過程中發(fā)生片段缺失；當克隆區(qū)域富含GC時丘侠，也難于在釀酒酵母中準確克隆徒欣。
3.2 Red/Rec技術
Red/Rec技術是一種基于λ噬菌體Red操縱子和Rec噬菌體RecE/RecT同源重組系統(tǒng)的DNA克隆技術。Red同源重組系統(tǒng)主要由Exo蜗字、Beta打肝、Gam蛋白組成，分別由λ噬菌體exo挪捕、bet粗梭、gam基因編碼。其中担神，Exo具有5′→3′雙鏈核酸外切酶活性楼吃，能夠形成末端DNA單鏈；Beta是單鏈結合蛋白妄讯，能夠促進DNA分子間退火孩锡；Gam能夠阻止單鏈DNA片段的降解，提高單鏈DNA分子的穩(wěn)定性亥贸，從而間接提高同源重組的效率躬窜。Rec同源重組系統(tǒng)中除上述Gam蛋白外，Rec噬菌體編碼的RecE和RecT蛋白也能高效促進同源重組[19]炕置。
相對于線型-線型同源重組(Linear-linear homologous recombination荣挨，LLHR)而言，Red/Rec同源重組系統(tǒng)對于線型-環(huán)型同源重組(Linear- circular homologous recombination朴摊，LCHR)更為高效(圖 6a)默垄。目前，在大腸桿菌中進行基因敲除最常用的PCR-targeting技術就是依賴于λRed系統(tǒng)介導的LCHR發(fā)展起來的[20]甚纲。
|
|
| 圖 6 λRed介導的LCHR(A)和全長的RecE/T介導的LLHR(B)Figure 6 LCHR mediated by λRed (A)and LLHR mediated by full-length RecE/T (B) |
|
|
2012年口锭，德國亥姆霍茲藥物研究院的Müller研究組證明了全長的RecE蛋白和RecT能夠高效促進線型-線型同源重組(圖 6b)，并利用該策略克隆了10個來自無色桿菌(Photorhabdus luminescens)的生物合成基因簇(10?52 kb)介杆，同時對其中兩個成功進行了異源表達[21]鹃操。此方法與傳統(tǒng)的文庫構建、篩選獲得含目的DNA片段的方法相比春哨，大大簡化了篩選流程荆隘，而且由于文庫構建具有隨機性、包裝容量有限赴背，通常難以直接得到含完整目的DNA片段的載體椰拒，而全長的RecE/T則能更容易獲得全長的目標基因簇晶渠。但是，相對于上述的TAR技術而言耸三，全長的RecE/T介導的LLHR只能克隆中等尺度的DNA大片段乱陡，而TAR則可以組裝更大尺度的DNA片段，甚至基因組仪壮。
4 單鏈退火拼接技術
單鏈退火拼接技術，即所謂的Chew-back組裝[22]胳徽，是指創(chuàng)造DNA分子之間的重疊區(qū)积锅，通過連接或聚合的思想實現(xiàn)分子間的拼接。這種技術既跳出了限制酶的使用养盗，利用DNA外切酶產生了較長的黏性末端缚陷；又應用等級化組裝模式很好地規(guī)避了逐級添加的耗時耗力與一次性組裝可能不正確的拼接，使得無論在組裝的DNA片段數(shù)目還是尺度上變得更為高效往核。例如目前最常用的Gibson assembly和SLIC技術箫爷。
4.1 Gibson assembly技術
Gibson assembly技術又被稱為“Gibson恒溫一步組裝法”，是美國J. CraigVenter研究所的Gibson等創(chuàng)建的一種DNA組裝方法[23]聂儒，即利用T5核酸外切酶虎锚、DNA聚合酶及連接酶的協(xié)同作用在體外將多個帶有末端重疊序列的DNA片段組裝起來。其中衩婚，T5核酸外切酶具有5′→3′核酸外切酶活性窜护，能夠從5′端切割有重疊區(qū)的DNA片段產生3′突出末端，然后該單鏈DNA的重疊序列在50 °C特異性退火(此時T5核酸外切酶逐漸失活)非春，最后DNA聚合酶和Taq連接酶修復連接而成的雙鏈DNA柱徙，從而形成完整的DNA分子，實現(xiàn)無縫拼接(圖 7)奇昙。
|
|
| 圖 7 Gibson拼接組裝流程Figure 7 Gibson assembly |
|
|
在2008年护侮，Gibson等在構建生殖道支原體基因組時，首先采用自創(chuàng)的體外變溫兩步組裝法獲得了支原體1/4大小基因組[16]储耐，然后對該技術進行改進羊初，將這4個超過100 kb的片段在體外組裝成了完整的583 kb的生殖支原體基因組。2010年弧岳，Gibson研究組又通過條件優(yōu)化將600個帶有20 bp重疊序列的60 bp的寡核苷酸在體外成功人工組裝合成了16.3 kb的小鼠線粒體基因組[24]凳忙。
由此可見，Gibson拼接技術可以簡單快速地實現(xiàn)多個DNA片段的一次性無縫組裝禽炬，而且組裝尺度非辰眩可觀，現(xiàn)已成功組裝的最大的DNA分子大小為1.08 Mb腹尖。但是隨著一次組裝的DNA片段的增多柳恐，其效率和正確率也會隨之降低，而且需要的重疊序列也較長，引物合成的費用也相應增加乐设。
4.2 SLIC(Sequence and ligation-independent cloning)技術
SLIC是一種不依賴于序列和連接反應的克隆方法[25]讼庇，主要利用T4 DNA聚合酶在無dNTPs存在的情況下發(fā)揮3′→5′核酸外切酶活性，將DNA片段消化產生含有末端重疊序列的5′黏性末端近尚，然后DNA片段之間或DNA片段與載體之間依靠重疊序列退火(Rec A可提高重組效率)蠕啄，形成環(huán)狀中間體，最后直接轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞戈锻，利用大腸桿菌本身的修復系統(tǒng)修復成完整的環(huán)狀重組質粒(圖 8)歼跟。2009年，美國哈佛醫(yī)學院的StephenElledge研究組利用SLIC實現(xiàn)了9個含40 bp末端重疊序列的DNA片段(275?980 bp)的一步拼接[26]格遭。
|
|
| 圖 8 SLIC標準流程Figure 8 SLIC assembly |
|
|
SLIC拼接法不需要連接酶哈街，也不需要考慮插入的DNA片段本身的序列，可以實現(xiàn)多個DNA片段的一次性組裝拒迅，是構建生物合成途徑的一個有效技術骚秦。目前，國外許多公司已經將其商業(yè)化璧微，例如Novagen公司的RadianceTM系統(tǒng)和Invitrogen公司的GatewayTM系統(tǒng)都是基于此技術開發(fā)出來的作箍。相對于上述Gibson assembly技術而言，SLIC只需要一種酶(T4 DNA聚合酶)即可完成多片段組裝往毡，而Gibson assembly則需要T5核酸外切酶蒙揣、DNA聚合酶及Taq連接酶的協(xié)同作用。但是該技術只能組裝中等尺度的DNA片段开瞭，而Gibson assembly則可以組裝高達580 kb的DNA大片段懒震。
此外，In-FusionTM Cloning[27]也是一種與SLIC類似的不依賴于連接反應的組裝技術嗤详，不同的是In-FusionTM Cloning使用的是一種功能類似的牛痘DNA聚合酶而非T4 DNA聚合酶个扰，而且它只需要15 bp的重疊序列，而SLIC則需要至少40 bp的重疊序列葱色。
5 總結與展望
綜上所述递宅，DNA克隆與組裝技術正處于一個快速發(fā)展的階段，除了本文中提到的一系列DNA組裝技術以外苍狰，許多其他技術也快速發(fā)展起來办龄。依賴于位點特異性重組酶的位點特異性重組(Site-specific recombination)可以對DNA片段進行一次性組裝[28, 29]，而且不會進入任何錯誤淋昭；依賴于特異性切割尿嘧啶的試劑的USER cloning[30]也是一種常用的DNA拼接技術俐填；依賴于單鏈退火拼接的一種連接酶循環(huán)克隆技術LCR[31]是一種高效高通量的體外DNA一步拼接法；枯草芽孢桿菌體內重組方法的發(fā)展也使其成為組裝基因組等大片段的候選底盤生物翔忽。此外英融，用于從特異性和非特異性PCR產物中克隆特異性目的片段的Quick and clean cloning技術[32]以及用于將外源DNA片段插入到目的載體的任何一個位置的Restriction-free cloning[33]和Transfer-PCR cloning[34]都是一些我們可以借鑒的DNA克隆技術盏檐。
當然，無論是非典型酶切連接技術還是依賴于PCR的技術驶悟，無論是體內的同源重組技術還是體外的單鏈退火拼接技術胡野，目前還沒有一個理想的組裝方法可以同時滿足無序列依賴性、無痕痕鳍、可按預設順序進行快速平行組裝硫豆，并同時適用于基因、生物合成途徑甚至是基因組的組裝笼呆。不同的組裝技術具有不同的適用性蚁吝，通常的策略都是幾項技術的聯(lián)合使用绵载。同時女责，要根據(jù)組裝的DNA分子尺度剂桥、能否容忍DNA片段連接處“疤痕”的存在及組裝序列的同源性程度等選擇最適合的方法袍镀。
毋庸置疑麦乞，未來的DNA組裝將大大受助于計算機軟件蚂夕，美國聯(lián)合生物能源研究所就針對相鄰片段之間序列依賴性的模塊化理解開發(fā)了一個專門的軟件包J5锹漱，能夠結合軟件利用機器人進行自動化組裝[35]胆屿。相信在可預見的未來奥喻，DNA合成將會更加快速、高效而廉價非迹，大規(guī)幕防穑基因組的合成將會成為現(xiàn)實；DNA組裝技術也會更加成熟憎兽，很可能作為現(xiàn)代分子克隆技術的一個重要工具得到廣泛的應用冷离。
參考文獻
| [1] | Valla S, Lale R. DNA cloning and assembly methods[A]//Methods in Molecular Biology[M]. New York: Humana Press, 2014, 1116: 1-303 |
| |
| [2] | Sleight SC, Bartley BA, Lieviant JA, et al. In-Fusion BioBrick assembly and re-engineering[J]. Nucleic Acids Research, 2010, 38(8): 2624-2636 |
| |
| [3] | Anderson JC, Dueber JE, Leguia M, et al. BglBricks: a flexible standard for biological part assembly[J]. Journal of Biological Chemistry, 2014, 4(1): 1 |
| |
| [4] | Vick JE, Johnson ET, Choudhary S, et al. Optimized compatible set of BioBrickTM vectors for metabolic pathway engineering[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2011, 92(6): 1275-1286 |
| |
| [5] | Chaudhary AK, Park JW, Yoon YJ, et al. Re-engineering of genetic circuit for 2-deoxystreptamine (2-DOS) biosynthesis in Escherichia coli BL21(DE3)[J]. Biotechnology Letters, 2013, 35(2): 285-293 |
| |
| [6] | Guo JH, Huang FL, Huang C, et al. Specificity and promiscuity at the branch point in gentamicin biosynthesis[J]. Chemistry & Biology, 2014, 21(5): 608-618 |
| |
| [7] | Engler C, Gruetzner R, Kandzia R, et al. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes[J]. PLoS One, 2009, 4(5): e5553 |
| |
| [8] | Kodumal SJ, Patel KG, Reid R, et al. Total synthesis of long DNA sequences: Synthesis of a contiguous 32-kb polyketide synthase gene cluster[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004, 101(44): 15573-15578 |
| |
| [9] | Chen WH, Qin ZJ, Wang J, et al. The MASTER (methylation-assisted tailorable ends rational) ligation method for seamless DNA assembly[J]. Nucleic Acids Research, 2013, 41(8):e93 |
| |
| [10] | Warrens AN, Jones MD, Lechler RI. Splicing by overlap extension by PCR using asymmetric amplification: an improved technique for the generation of hybrid proteins of immunological interest[J]. Gene, 1997, 186(1): 29-35 |
| |
| [11] | Wei HL, Hu J, Wang L, et al. Rapid gene splicing and multi-sited mutagenesis by one-step overlap extension polymerase chain reaction[J]. Analytical Biochemistry, 2012, 429(1): 76-78 |
| |
| [12] | Dickschat JS, Vergnolle O, Hong H, et al. An additional dehydratase-like activity is required for lankacidin antibiotic biosynthesis[J]. ChemBioChem, 2011, 12(16): 2408-2412 |
| |
| [13] | Quan JY, Tian JD. Circular polymerase extension cloning of complex gene libraries and pathways[J]. PLoS One, 2009, 4(7): e6441 |
| |
| [14] | Kouprina N, Larionov V. TAR cloning: insights into gene function, long-range haplotypes and genome structure and evolution[J]. Nature Reviews Genetics, 2006, 7(10): 805-812 |
| |
| [15] | Gibson DG. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides[J]. Nucleic Acids Research, 2009, 37(20): 6984-6990 |
| |
| [16] | Gibson DG, Benders GA, Andrews-Pfannkoch C, et al. Complete chemical synthesis, assembly, and cloning of a Mycoplasma genitalium genome[J]. Science, 2008, 319(5867): 1215-1220 |
| |
| [17] | Gibson DG, Benders GA, Axelrod KC, et al. One-step assembly in yeast of 25 overlapping DNA fragments to form a complete synthetic Mycoplasma genitalium genome[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2008, 105(51): 20404-20409 |
| |
| [18] | Gibson DG, Glass JI, Lartigue C, et al. Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome[J]. Science, 2010, 329(5987): 52-56 |
| |
| [19] | Ni XP, Ji ZX, Xia HZ. Manipulation of large DNA fragment using homologous recombination[J]. Journal of Shenyang Pharmaceutical University, 2014, 31(8): 663-668 (in Chinese)倪現(xiàn)樸, 季州翔, 夏煥章. 同源重組方法在制備DNA大片段中的應用[J]. 沈陽藥科大學學報, 2014, 31(8): 663-668 |
| |
| [20] | Gust B, Challis GL, Fowler K, et al. PCR-targeted Streptomyces gene replacement identifies a protein domain needed for biosynthesis of the sesquiterpene soil odor geosmin[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2003, 100(4): 1541-1546 |
| |
| [21] | Fu J, Bian XY, Hu SB, et al. Full-length RecE enhances linear-linear homologous recombination and facilitates direct cloning for bioprospecting[J]. Nature Biotechnology, 2012, 30(5): 440-446 |
| |
| [22] | Li L, Lu YH, Jiang WH. Perspective on the novel methods for DNA assembly[J]. Chinese Journal of Biotechnology, 2013, 29(8): 1113-1122 (in Chinese)李雷, 盧銀華, 姜衛(wèi)紅. DNA組裝新方法的研究進展[J]. 生物工程學報, 2013, 29(8): 1113-1122 |
| |
| [23] | Gibson DG, Young L, Chuang RY, et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases[J]. Nature Methods, 2009, 6(5): 343-345 |
| |
| [24] | Gibson DG, Smith HO, Hutchison CA III, et al. Chemical synthesis ofthe mouse mitochondrial genome[J]. Nature Methods, 2010, 7(11): 901-903 |
| |
| [25] | Li MZ, Elledge SJ. SLIC: a method for sequence- and ligation-independent cloning[A]//Methods and Protocols.Methods in Molecular Biology[M]. New York: Humana Press, 2012, 852: 51-59 |
| |
| [26] | Li MZ, Elledge SJ. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC[J]. Nature Methods, 2007, 4(3): 251-256 |
| |
| [27] | Berrow NS, Alderton D, Owens RJ. The precise engineering of expression vectors using high-throughput In-FusionTM PCR cloning[A]//High Throughput Protein Expression and Purification. Methods in Molecular Biology[M]. New York: Humana Press, 2009, 498: 75-90 |
| |
| [28] | Herrmann S, Siegl T, Luzhetska M, et al. Site-specific recombination strategies for engineering actinomycete genomes[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2012, 78(6): 1804-1812 |
| |
| [29] | Colloms SD, Merrick CA, Olorunniji FJ, et al. Rapid metabolic pathway assembly and modification using serine integrase site-specific recombination[J]. Nucleic Acids Research, 2014, 42(4): e23 |
| |
| [30] | Nour-Eldin HH, Geu-Flores F, Halkier BA. USER cloning and USER fusion: the ideal cloning techniques for small and big laboratories[A]//Plant Secondary Metabolism Engineering. Methods in Molecular Biology[M]. New York: Humana Press, 2010, 643: 185-200 |
| |
| [31] | de KS, Stanton LH, Slaby T, et al. Rapid and reliable DNA assembly via ligase cycling reaction[J]. ACS Synthetic Biology, 2014, 3(2): 97-106 |
| |
| [32] | Thieme F, Engler C, Kandzia R, et al. Quick and clean cloning: a ligation-independent cloning strategy for selective cloning of specific PCR products from non-specific mixes[J]. PLoS One, 2011, 6(6): e20556 |
| |
| [33] | Bond SR, Naus CC. RF-Cloning. org: an online tool for the design of restriction-free cloning projects[J]. Nucleic Acids Research, 2012, 40(Web Server issue1): W209-W213 |
| |
| [34] | Erijman A, Dantes A, Bernheim R, et al. Transfer-PCR (TPCR): a highway for DNA cloning and protein engineering[J]. Journal of Structural Biology, 2011, 175(2): 171-177 |
| |
| [35] | Hillson NJ, Rosengarten RD, Keasling JD. j5 DNA assembly design automation software[J]. ACS Synthetic Biology, 2012, 1(1): 14-21 |
Gibson Assembly 在單管反應中采用三種酶活性：5′ 核酸外切酶、DNA 聚合酶的 3′ 延伸活性和 DNA 連接酶活性纯命。 5′ 核酸外切酶活動回咬 5′ 末端序列并暴露互補序列以進行退火西剥。 然后聚合酶活性填充退火區(qū)域的間隙。 然后 DNA 連接酶密封切口并將 DNA 片段共價連接在一起亿汞。 相鄰片段的重疊序列比 Golden Gate Assembly 中使用的序列長得多瞭空，因此導致正確組裝的百分比更高。 NEB Gibson Assembly Master Mix (NEB #E2611) 和 Gibson Assembly Cloning Kit (NEB #E5510S) 能夠在 50?C 下快速組裝疗我。
