Single-Cell Sequencing of Peripheral Mononuclear Cells Reveals Distinct Immune Response Landscapes of COVID-19 and Influenza Patients

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https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1074761320303162#mmc1

影響因子： 22.553PMID：32783921

期刊年卷：Immunity 2020 09 15;533(3)

醫(yī)學(xué)一區(qū) 免疫學(xué) Q1 4/155

DOI：10.1016/j.immuni.2020.07.009

亮點(diǎn)：

1. 作者在 COVID-19 和流感患者中生成了 PBMC 單細(xì)胞圖集

2. COVID-19 和流感患者的血漿細(xì)胞顯著增加

3. COVID-19 具有 XAF1垃帅，TNF-α和FAS誘導(dǎo)的T細(xì)胞凋亡的特征

4. 與流感病毒（STAT3 /NFκB）相比柿祈，COVID-19激活了獨(dú)特的途徑（STAT1 / IRF3）

2019年冠狀病毒采取（COVID-19）大流行構(gòu)成了當(dāng)前全球范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生威脅鸽扁。但是飘诗，與其他傳染病相比欢嘿，人們對(duì)其標(biāo)志的了解還很少密似。在這里吗垮，作者報(bào)告了在COVID-19和甲型流感病毒（IAV）感染的患者中，縱向收集的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄態(tài)勢(shì)盯蝴。作者觀察到COVID-19和IAV患者的血漿細(xì)胞增加毅哗，而XIAP相關(guān)因子1（XAF1），腫瘤壞死因子（TNF）和FAS誘導(dǎo)的COVID-19患者T細(xì)胞凋亡增加捧挺。進(jìn)一步的分析顯示虑绵，COVID-19（STAT1和IRF3）與IAV（STAT3和NFκB）患者相比，激活的信號(hào)通路不同闽烙，并且關(guān)鍵因子的表達(dá)存在明顯差異翅睛。與 IAV 患者不同声搁，IL6R 和 IL6ST 的表達(dá)在 COVID-19 患者中被上調(diào)，這在發(fā)病過(guò)程中協(xié)同促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的增加捕发。作者還發(fā)現(xiàn)疏旨，幾個(gè)干擾素（IFN）刺激的基因（ISG；包括 ISG15扎酷，IFI44檐涝，IFI44L 和 RSAD2）在 COVID-19 患者的 PBMC 中被特異性上調(diào)，增強(qiáng)了病毒感染后的抗病毒和免疫調(diào)節(jié)功能法挨。支持了COVID-19患者中促炎細(xì)胞因子增加的臨床觀察谁榜。因此，作者提供了PBMC的概況凡纳，并揭示了COVID-19和IAV患者的獨(dú)特免疫應(yīng)答途徑窃植。

結(jié)果

COVID-19 和 IAV 患者的 PBMC 的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄景觀

為了調(diào)查 COVID-19 患者中 SARS-CoV-2 感染的發(fā)病機(jī)理和機(jī)制，從三個(gè)健康對(duì)照荐糜，兩名 IAV 感染患者和五名 COVID-19 患者（包括四名患者（COV-1 至 COV） -4）病程簡(jiǎn)單巷怜，一名患者（COV-5）隨后病情加重（圖1A；表S1）暴氏。選擇季節(jié)性感染 IAV 的患者作為對(duì)照延塑，因?yàn)?SARS-CoV-2 和 IAV 均為傳染性 RNA 病毒，均引起呼吸道感染偏序。但是页畦，與 IAV 感染相比，COVID-19 具有明顯的臨床特征研儒，包括高發(fā)病率和高死亡率豫缨。根據(jù)陽(yáng)性核酸檢測(cè)結(jié)果，在癥狀發(fā)作的 5-10 天內(nèi)招募了 COVID-19 患者端朵，并將首次收集 PBMC 的日期命名為第 1 天好芭。表S1中列出了與疾病發(fā)作和樣本收集相對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)。如圖1A 所示冲呢，在隨后的時(shí)間點(diǎn)也收集了 PBMC舍败。過(guò)濾出低質(zhì)量的細(xì)胞后，作者從 46,022 個(gè)細(xì)胞中獲得了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集敬拓，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每個(gè)參與者平均有 2,000 個(gè)細(xì)胞（圖1B）邻薯。為了發(fā)現(xiàn) COVID-19 中的免疫細(xì)胞群，作者進(jìn)行了無(wú)監(jiān)督的聚類并獲得了 15 個(gè)細(xì)胞群（圖1C）乘凸。根據(jù)經(jīng)典細(xì)胞類型標(biāo)記物的表達(dá)厕诡，可以鑒定出免疫細(xì)胞，例如 T 細(xì)胞营勤，B 細(xì)胞灵嫌，單核細(xì)胞壹罚，自然殺傷（NK）細(xì)胞，DC寿羞，干細(xì)胞和巨核細(xì)胞（圖1C）猖凛。通過(guò)這種方法，5 個(gè)群體注釋為 T 細(xì)胞绪穆，包括幼稚 T 細(xì)胞（CD3+CCR7+GZMA-）辨泳，活化的 CD4+T 細(xì)胞（CD3+CD4+IL7R+），細(xì)胞毒性 CD8+T 細(xì)胞（CD3+CD8+GZMA+）玖院，粘膜相關(guān)不變性 T 細(xì)胞（MAIT 細(xì)胞漠吻；CD3+SLC4A10+）和循環(huán)性 T 細(xì)胞（CD3+MKI67+）；四個(gè)群體注釋為 B 細(xì)胞司恳，包括幼稚 B 細(xì)胞（MS4A1+IGHG1-），漿細(xì)胞（MZB1+IGHG1+）绍傲，循環(huán)血漿細(xì)胞（MZB1+IGHG1+MKI67+）扔傅，和記憶 B 細(xì)胞（MS4A1+IGHG1+） ; 其中兩個(gè)被標(biāo)注為 NK 細(xì)胞（KLRF1+）；一個(gè)種群被標(biāo)記為 DC（CD1C+LYZ+）和單核細(xì)胞（LYZ+CD68+）（圖1D 和S1A）烫饼。大多數(shù)簇由多名患者的細(xì)胞組成猎塞，表明患者之間具有共同的免疫特征。此外杠纵，來(lái)自患者的 PBMC 樣本不表達(dá)ACE2和TMPRSS2受體荠耽，并且不顯示病毒讀數(shù)，表明 SARS-CoV-2 可能不會(huì)感染 PBMC（圖S1B）比藻。

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圖 1 參與者的 PBMC 衍生的免疫細(xì)胞的單細(xì)胞基因表達(dá)譜

（A）研究設(shè)計(jì)的示意圖铝量。這項(xiàng)研究包括 10 名受試者，包括 3 名健康捐獻(xiàn)者银亲，5 名 COVID-19 患者和 2 名受 IAV 感染的患者慢叨。

（B）條形圖顯示了在不同時(shí)間點(diǎn)每個(gè)供體的每個(gè)樣品的 log10轉(zhuǎn)化細(xì)胞數(shù)。藍(lán)色代表三位健康的供體务蝠，橙色代表兩名被 IAV 感染的患者拍谐，五名使用五種不同顏色顯示的 COVID-19 患者。

（C）來(lái)自十個(gè)供體的 46022 個(gè)細(xì)胞的聚類結(jié)果馏段。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)單個(gè)細(xì)胞轩拨，根據(jù)細(xì)胞類型進(jìn)行著色。巨核細(xì)胞院喜。

（D）細(xì)胞類型簇中細(xì)胞分型基因的表達(dá)水平亡蓉。CD3G 指示 T 細(xì)胞，KLRF1 和 XCL1 指示 NKs够坐，MS4A1 指示 B 細(xì)胞寸宵，IGHG1 和 MZB1 指示漿細(xì)胞崖面，CD68 指示單核細(xì)胞，LYZ 指示 DCs梯影，MKI67 和 TOP2A 指示循環(huán)的 T 細(xì)胞巫员，GZMA 指示細(xì)胞毒性 CD8+T 細(xì)胞和 NKs，和 PPBP 表示巨核細(xì)胞甲棍。

另請(qǐng)參見(jiàn)圖S1和表S1简识。

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COVID-19 和 IAV 患者的 PBMC 中的漿細(xì)胞增加

PBMC 人群的一般模式在患者之間是可比的（圖2A；表S2）感猛。在感染 COVID-19 和 IAV 的患者中七扰，漿細(xì)胞和循環(huán)漿細(xì)胞的比例均顯著增加（圖2B 和S2），這兩種類型的病毒感染之間沒(méi)有差異陪白。增加的漿細(xì)胞可以誘導(dǎo)保護(hù)性中和抗體颈走，以防止病毒感染細(xì)胞。不出所料咱士，當(dāng)檢查 COVID-19 患者 B 細(xì)胞中上調(diào)基因的功能與健康供體相比時(shí)立由，蛋白質(zhì)復(fù)合物裝配和蛋白質(zhì)運(yùn)輸相關(guān)途徑尤其豐富，這可能是因?yàn)樵诖似陂g合成了大量蛋白質(zhì)處理（圖2C）序厉。B 細(xì)胞激活相關(guān)的途徑也得到了豐富（圖2C）锐膜，代表性基因包括PRDM1，XBP1和IRF4（圖2D）弛房。漿細(xì)胞的身份和功能取決于轉(zhuǎn)錄因子PRDM1道盏，XBP1和IRF4（Ochiai等人，2013文捶；Shaffer等人荷逞，2004）。PRDM1在確定和塑造成熟 B 細(xì)胞分化的分泌臂并促進(jìn)免疫球蛋白（Ig）合成中起著核心作用拄轻。XBP1在 CREB-ATF 家族中颅围，它是一種正向轉(zhuǎn)錄因子，在漿細(xì)胞中大量表達(dá)恨搓，對(duì)于增加漿細(xì)胞中的蛋白質(zhì)合成至關(guān)重要（Shaffer等院促，2004）。IRF4調(diào)節(jié)免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換的重組斧抱，并且持續(xù)且較高濃度的IRF4可以促進(jìn)漿細(xì)胞的生成（Ochiai等人常拓，2013）。繼漿細(xì)胞增加和相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)后辉浦，作者發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照組相比弄抬，活化的 CD4+T 細(xì)胞上CD2AP的表達(dá)升高（圖2E）。CD4+中的銜接子分子 CD2APT 細(xì)胞調(diào)節(jié)濾泡輔助性 T 細(xì)胞的分化并改善病毒感染中的保護(hù)性抗體反應(yīng)（Raju等人宪郊，2018）掂恕。除了支持漿細(xì)胞功能外拖陆，在活化的 CD4+T 細(xì)胞和細(xì)胞毒性 CD8+T 細(xì)胞中，TNFSF14 的表達(dá)也增加了懊亡。這些因子促進(jìn) T 細(xì)胞活化以及 T 細(xì)胞從外周血中募集到組織中依啰。KDM5A編碼 NK 細(xì)胞和 T 細(xì)胞活化所需的 H3K4me3 脫甲基酶，在 NK 細(xì)胞和 COVID-19 的細(xì)胞毒性 CD8+T 細(xì)胞中被上調(diào)（圖2E）店枣。綜上所述速警，這些結(jié)果表明，在 COVID-19 患者中漿細(xì)胞的升高以及 T 細(xì)胞和 NK 細(xì)胞活化的增強(qiáng)可能有助于抵抗病毒鸯两。

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圖 2. SARS-CoV-2 感染期間免疫細(xì)胞的動(dòng)態(tài)組成和功能變化

（A）每個(gè)樣品中的細(xì)胞類型頻率闷旧。條形按細(xì)胞類型著色。

（B）來(lái)自健康供體（Ctrl）（n = 3）钧唐，COVID-19 患者（COV）（n = 16）和 IAV 患者（IAV）（n = 4）的樣本之間血漿和循環(huán)血漿比例的差異忙灼。使用學(xué)生 t 檢驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)差異的顯著性。p <0.05钝侠，p <0.01缀棍，**p <0.001。

（C）與 B 細(xì)胞中健康對(duì)照相比机错，COVID-19 患者中上調(diào)基因的 GO 術(shù)語(yǔ)富集。

（D）健康供體（Ctrl）和 COVID-19 患者（COV）在漿細(xì)胞中 B 細(xì)胞激活相關(guān)基因PRDM1父腕，XBP1和IRF4的差異表達(dá)水平弱匪。

（E）健康供體和 COVID-19 患者樣品中活化的 CD4+T 細(xì)胞，細(xì)胞毒性 CD8+T 細(xì)胞和 NK 中 T 細(xì)胞活化相關(guān)基因的表達(dá)水平璧亮。在上圖中萧诫，每個(gè)點(diǎn)的顏色代表基因的表達(dá)水平，而點(diǎn)的大小代表在特定細(xì)胞類型中表達(dá)基因的細(xì)胞比例枝嘶。在下部面板中帘饶，使用學(xué)生 t 檢驗(yàn)測(cè)試了健康捐獻(xiàn)者（Ctrl）（n = 3）和 COVID-19 患者（COV）（n = 16）之間的差異。p <0.05群扶，p <0.01及刻，**p <0.001。

另請(qǐng)參見(jiàn)圖S2和表S2竞阐。

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COVID-19 患者的 IFN 反應(yīng)和淋巴細(xì)胞凋亡

進(jìn)行基因本體論（GO）分析以深入了解 COVID-19 患者和健康對(duì)照之間不同細(xì)胞亞群的功能缴饭。“對(duì) I 型 IFN 信號(hào)的響應(yīng)”組中的基因富含 D1 和 D4 的 T骆莹，B 和 NK 細(xì)胞亞群颗搂，但不包含 D16 樣品（圖3A 和S3A），這與 IFN 反應(yīng)是對(duì)于病毒感染引發(fā)的反應(yīng)至關(guān)重要幕垦。一致地丢氢，“對(duì)病毒信號(hào)的防御反應(yīng)”基因也在 D1 和 D4 而非 D16 的所有五名 COVID-19 患者的 T傅联，B 和 NK 細(xì)胞中富集（圖3A 和S3）A），表明持續(xù)不斷的針對(duì) SARS-CoV-2 病毒的免疫反應(yīng)疚察。此外蒸走，內(nèi)質(zhì)和蛋白質(zhì)解折疊相關(guān)的途徑在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)（D1，D4 和 D16）都特別富集于 B 細(xì)胞中（圖3A 和S3A）稍浆，這可能是由于血漿比例更高由于抗體生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)蛋白質(zhì)合成的需求很高载碌，因此 B 細(xì)胞簇中的 B 細(xì)胞具有很高的免疫力。SARS-CoV-2 感染中的其他信號(hào)傳導(dǎo)途徑衅枫，例如“染色體組織的調(diào)控”嫁艇，“ DNA 構(gòu)象變化”等也被上調(diào)。這些基因的作用需要進(jìn)一步研究弦撩。

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圖 3 COVID-19 患者與 IFN 應(yīng)答和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的分析

（A）與不同細(xì)胞群體中的健康對(duì)照相比步咪，COVID-19 患者第 1 天樣品中通過(guò) GO 分析獲得的前 20 個(gè)豐富的生物學(xué)過(guò)程。點(diǎn)顏色表示富集的統(tǒng)計(jì)顯著性（p）益楼，點(diǎn)大小表示每個(gè)術(shù)語(yǔ)均注明的基因比例猾漫。

（B）與不同細(xì)胞亞群中健康對(duì)照相比，來(lái)自 COVID-19 患者的第 1 天樣品中差異表達(dá)的基因感凤。紅點(diǎn)代表 COVID-19 患者的上調(diào)基因（調(diào)整后的 p <0.01 且倍數(shù)變化（FC）≥2）悯周，而藍(lán)點(diǎn)代表COVID-19患者的下調(diào)基因（調(diào)整后的p <0.01和FC≤0.5）。log2（FC）≥1.5的基因用基因符號(hào)標(biāo)記陪竿。

（C）ISG15禽翼，IFI44L，MX1和XAF1在健康供體（Ctrl）（n = 3）和 COVID-19 患者（COV）（n = 16）中的基因表達(dá)族跛。使用學(xué)生 t 檢驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)差異的顯著性闰挡。p <0.05，p <0.01礁哄，**p <0.001长酗。

（D）基因通過(guò) mfuzz R 包裝沿著疾病的進(jìn)展按其表達(dá)模式聚集。

（E）GO 分析顯示桐绒，每個(gè)基因簇中的前 10 個(gè)富集的生物過(guò)程夺脾。

（F）T 細(xì)胞中 COVID-19 患者（COV）（n = 5）和健康對(duì)照（Ctrl）（n = 3）之間凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平的差異。應(yīng)用了學(xué)生 t 檢驗(yàn)茉继。p <0.05劳翰，p <0.01，**p <0.001馒疹。

另請(qǐng)參見(jiàn)圖S3和表S3佳簸。

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然后在 COVID-19 患者和健康對(duì)照之間比較這些轉(zhuǎn)錄組譜中的差異表達(dá)基因（DEG）。在 D1 和 D4 感染 SARS-CoV-2 的患者中鑒定出了對(duì)早期病毒控制至關(guān)重要的 ISG（Schoggins和Rice，2011年）（圖3B 和S3B）生均，這與“response to type I IFN signaling"/GO分析中的“ I型IFN信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”途徑相符（圖3A 和S3A）听想。在這些 ISG 中，ISG15马胧，IFI44L燕耿，MX1和X 連鎖的凋亡抑制因子（XIAP）相關(guān)因子 1（XAF1）在 T侍咱，B，NK 和 DC 細(xì)胞亞群中上調(diào)（圖3B 和S3B）。與健康對(duì)照相比郭膛，這四個(gè)基因在 COVID-19 患者中的表達(dá)水平也要高得多（圖3C）横堡。然后粪薛，作者在疾病過(guò)程中檢查了這些基因的轉(zhuǎn)錄動(dòng)力學(xué)掘宪。為此，作者將 COVID-19 患者從癥狀發(fā)作到出院的疾病過(guò)程分為四個(gè)階段（表S3）歇盼。作者鑒定了六個(gè)時(shí)間依賴性表達(dá)模式（圖3D）并研究了它們的生物學(xué)意義（圖3E）舔痕。聚類 3 包含 158 個(gè)基因，這些基因隨著時(shí)間的推移表達(dá)水平下降豹缀。這些基因的功能在與 IFN 反應(yīng)相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程中顯著豐富伯复，表明這些基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是動(dòng)態(tài)的，并且它們?cè)谠缙跁r(shí)間點(diǎn)被激活而在晚期時(shí)間點(diǎn)被去激活（圖3E）邢笙。簇 1 包含 38 個(gè)基因啸如，其表達(dá)水平從第 2 階段開(kāi)始升高。GO 富集分析表明其功能在翻譯和蛋白質(zhì)合成相關(guān)途徑中顯著富集氮惯。這與抗體生產(chǎn)的時(shí)機(jī)一致（Thevarajan等组底，2020），因?yàn)樵诖诉^(guò)程中會(huì)發(fā)生大量蛋白質(zhì)合成（圖3E）筐骇。

重度患者（COV-5）對(duì) SARS-CoV-2 感染后對(duì) IFNa 的反應(yīng)比輕度患者強(qiáng)。此外江滨，ISG15铛纬，IFI44L，MX1和XAF1 的表達(dá)在疾病進(jìn)展的較早時(shí)間點(diǎn)較高唬滑，然后在以后的各個(gè)階段分別降低（圖S3C）告唆，說(shuō)明它們對(duì)干擾素的動(dòng)態(tài)反應(yīng)。

泛素樣蛋白 ISG15晶密，IFI44L 和 MX1 均在抗病毒反應(yīng)中起作用（Perng和Lenschow擒悬，2018年），而 XAF1 參與促凋亡反應(yīng)稻艰，并且據(jù)報(bào)道與 IRF-1 形成正反饋回路懂牧，從而驅(qū)動(dòng)壓力下的細(xì)胞凋亡（Jeong等，2018）。XAF1 還通過(guò)翻譯后修飾增強(qiáng)了 TP53 介導(dǎo)的凋亡（Zou等僧凤，2012）畜侦，因此，分析了與 XAF1 介導(dǎo)的凋亡相關(guān)的基因躯保，包括IRF1旋膳，TP53，BCL2L11和CASP3（圖S3）D）途事。IRF1验懊，TP53和CASP3 的表達(dá)與對(duì)照組相比，COVID-19 患者的 T尸变，B 和 NK 細(xì)胞亞群的 Bcl2 升高义图，而BCL2L11在不同細(xì)胞亞群中表現(xiàn)出不同的模式。除了 XAF1 相關(guān)的凋亡途徑外振惰，還在 COVID-19 患者和健康對(duì)照者中檢查了其他與凋亡相關(guān)的途徑中的基因表達(dá)歌溉，包括 TNF 和 Fas 途徑（Elmore，2007年）（圖3F 和S3E）骑晶。相對(duì)于健康對(duì)照痛垛，COVID-19 患者的 T 細(xì)胞中TNFSF10（TRAIL）及其受體TNFRSF10A的表達(dá)增加。其他 TNF 通路成員桶蛔，包括TNFRSF1B匙头，在 COVID-19 患者中也相對(duì)上調(diào)。至于 FAS 途徑仔雷，在 COVID-19 患者的 T 細(xì)胞中蹂析，FAS，FASLG和FADD的表達(dá)上調(diào)碟婆，盡管不顯著（圖3F）电抚。在 B 和 NK 細(xì)胞亞群中，在 COVID-19 患者中TNFSF10和FADD顯著增加竖共，其他基因輕度升高蝙叛，除了 B 細(xì)胞中的Fas和 NK 細(xì)胞中的TRADD顯著降低（圖S3E）。綜上所述公给，作者發(fā)現(xiàn)與 XAF1借帘，TNF 和 Fas 途徑相關(guān)的上調(diào)基因可能導(dǎo)致 COVID-19 患者的 T 細(xì)胞凋亡增加。

與 IAV 患者相比淌铐，COVID-19 患者的免疫分子特征

接下來(lái)肺然，作者試圖鑒定與 COVID-19 和 IAV 感染相關(guān)的免疫分子標(biāo)記。因此腿准，作者比較了 COVID-19 患者际起，IAV 患者和健康對(duì)照者的 T 細(xì)胞亞群，NK 細(xì)胞和 DC 中細(xì)胞因子，細(xì)胞因子受體和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)（圖4A 和S4A）加叁。正如基因聚類模式所暗示的那樣倦沧，COVID-19 患者中上調(diào)的基因大多編碼促炎性細(xì)胞因子，細(xì)胞因子受體和 IFN 反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子它匕，而在 IAV 患者中展融，促炎性轉(zhuǎn)錄因子和與病毒相互作用的宿主因子似乎高度表達(dá)。

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圖 4 與 IAV 相比豫柬，COVID-19 的標(biāo)志（通過(guò)細(xì)胞因子告希，細(xì)胞因子受體和轉(zhuǎn)錄因子的單細(xì)胞分析顯示）

（A）在活化的 CD4+T 細(xì)胞群體中，COVID-19 患者烧给，IAV 患者和健康對(duì)照中關(guān)鍵細(xì)胞因子燕偶，細(xì)胞因子受體和轉(zhuǎn)錄因子的相對(duì)表達(dá)水平（Z評(píng)分）。

（B）在 IAV 患者的活化 CD4+T 細(xì)胞中高度表達(dá)的四個(gè)代表性基因的表達(dá)水平础嫡。上圖：點(diǎn)圖中每個(gè)點(diǎn)的顏色表示基因的表達(dá)水平指么；點(diǎn)大小代表在活化的 CD4+T 細(xì)胞群體中表達(dá)該基因的細(xì)胞分?jǐn)?shù)。下圖：來(lái)自 COVID-19 患者（COV）（n = 16）榴鼎，IAV 患者（IAV）（n = 4）和健康供體（Ctrl）（n = 3）的樣本之間基因表達(dá)的差異伯诬。方框圖中的每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣品中激活的 CD4+T 細(xì)胞群體中某個(gè)基因的平均表達(dá)水平。使用學(xué)生 t 檢驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)差異的顯著性巫财。?p <0.05盗似，??p <0.01，???p ＜0.001平项。

（C）與（B）相似赫舒，顯示了在 COVID-19 患者的活化 CD4+T 細(xì)胞中高表達(dá)的四個(gè)代表性基因。

另請(qǐng)參閱圖S4闽瓢。

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參與宿主的免疫反應(yīng)接癌，其中包括多個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子STAT3，NFKB1扣讼，和REL缺猛，在從 IAV 例（各種細(xì)胞類型中上調(diào)圖4A 和S4A）。NFKB1和REL編碼 NF-κB異二聚體的活性亞基届谈，NF-κB異二聚體是被IAV感染激活的標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子之一（Ludwig和Planz，2008年）弯汰。NF-κB的激活在調(diào)節(jié)促炎性先天免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用艰山。先前的研究表明，嚴(yán)重的IAV患者中STAT3信號(hào)傳導(dǎo)的已知激活因子IL-6和IL-10顯著增加（Yu等人咏闪，2011年）曙搬。與 COVID-19 患者和健康對(duì)照組相比，IAV 患者中STAT3 的表達(dá)升高，并且似乎與入院后的時(shí)間相關(guān)纵装。此外征讲，與其他組相比，IAV 患者的活化 CD4+T 細(xì)胞中RUNX3表達(dá)上調(diào)（圖4B）橡娄。有人認(rèn)為诗箍，RUNX3 誘導(dǎo)是 CD4+T 細(xì)胞獲得細(xì)胞毒活性的關(guān)鍵步驟，而另一項(xiàng)研究表明挽唉，IAV 通過(guò) NF-κB途徑感染的RUNX3促進(jìn)了氣道上皮細(xì)胞的凋亡（Gan等滤祖，2015）。）瓶籽。RUNX3 在 T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中的作用尚待確定匠童。幾種前病毒宿主因素，例如CHD1塑顺，BCLAF1和PHF3有助于病毒感染汤求，復(fù)制和免疫逃避也上調(diào)在 IAV 例（圖4A 和S4A）（夏皮拉等人，2009年）严拒。為了了解這些基因的響應(yīng)隨時(shí)間如何變化扬绪，作者將 IAV 患者的疾病過(guò)程分為兩個(gè)階段（表S3）。作者沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的時(shí)間依賴性調(diào)節(jié)基因糙俗，盡管其中一些具有表達(dá)增加或減少的趨勢(shì)（圖S4B 和 S4C）勒奇。

對(duì)于 COVID-19 患者，STAT1 是響應(yīng)干擾素而激活的主要轉(zhuǎn)錄因子巧骚，在激活的 CD4+T 細(xì)胞赊颠，細(xì)胞毒性 CD8+T 細(xì)胞，幼稚 T 細(xì)胞和 DC 中上調(diào)（圖4A 和S4A）劈彪】⒈模活化的 CD4+T 細(xì)胞，細(xì)胞毒性 CD8+T 細(xì)胞沧奴，MAIT 細(xì)胞和 NK 細(xì)胞中的幾種促炎因子（包括 TNF 和 TNFSF14）升高（圖S4A 和 S4E）痘括，表明效應(yīng)子功能和記憶細(xì)胞發(fā)育增強(qiáng)（Desai等。滔吠，2018）纲菌。IL6 的表達(dá)在任何患者或健康對(duì)照的 PBMC 中均未檢出。作者在這些 COVID-19 患者的住院期間以及出院后測(cè)量了 IL-6 的血漿濃度（圖S4D）疮绷。五分之二的患者入院時(shí)血漿 IL-6 高于正常范圍（0.0–7.0 pg / mL）（Chen等翰舌，2020），住院期間恢復(fù)正常冬骚，恢復(fù)后保持穩(wěn)定椅贱。大多數(shù) COVID-19 患者的 IL-6 處于上升階段懂算，表明有活躍的炎癥反應(yīng)，這在 IAV 患者中也觀察到（Yu等人庇麦，2011年）计技。具有嚴(yán)重癥狀的患者住院時(shí)的 IL-6 水平要高得多，恢復(fù)正常血漿 IL-6 水平所花費(fèi)的時(shí)間更長(zhǎng)山橄，這與疾病的嚴(yán)重程度相對(duì)應(yīng)垮媒。

IL-6 通過(guò)與 IL-6R 結(jié)合而發(fā)揮其功能。然后驾胆，IL-6-IL-6R 復(fù)合物與 GP130（IL-6 受體亞基β[IL6ST]）結(jié)合涣澡，GP130是由幾種相關(guān)細(xì)胞因子共享的常見(jiàn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈（Mihara等，2012）丧诺。的表達(dá)IL6R在活化的 CD4 升至+T 細(xì)胞入桂，幼稚 T 細(xì)胞，和 COVID-19 的患者的 DCs 相比 IAV 患者和健康對(duì)照（圖4C 和S4A）驳阎。同時(shí)抗愁， 與健康對(duì)照相比，COVID-19 患者和 IAV 患者在各種細(xì)胞類型中IL6ST 的表達(dá)上調(diào)呵晚。據(jù)報(bào)道蜘腌，IL-6R 經(jīng)常從活化的 T 細(xì)胞膜上脫落，于是它與 IL-6 的可溶性形式結(jié)合并以反式作用在表達(dá) IL6ST 的細(xì)胞上饵隙。通過(guò) IL6ST 進(jìn)行的此類 IL-6 反信號(hào)可能顯著促進(jìn) IL-6 的促炎特性（Wolf等人撮珠，2014年），強(qiáng)調(diào)了當(dāng)前研究中觀察到的IL6ST上調(diào)的潛在重要性金矛。

根據(jù)臨床觀察芯急，COVID-19 患者的炎癥細(xì)胞因子（例如 IFN-α2，IL-7驶俊，IL-17和IL-10）的血漿濃度高于健康成年人（Huang等娶耍，2020）。在 COVID-19 患者饼酿，IAV 患者和健康對(duì)照中比較了活化 CD4+T 細(xì)胞榕酒，細(xì)胞毒性 CD8+T 細(xì)胞，MAIT 細(xì)胞和 NK 細(xì)胞中相應(yīng)受體的表達(dá)水平故俐。（圖S4E）想鹰。與健康對(duì)照組相比，在 COVID-19 患者的這些細(xì)胞類型中药版，IFNAR1（干擾素α/β受體的α鏈）的上調(diào)是顯著的辑舷。值得注意的是，在激活的CD4+T 刚陡，IL-7惩妇，IL-17和IL-27的受體亞基與IFNAR1一起顯著升高COVID-19患者的T細(xì)胞與其他組相比，表明CD4+T細(xì)胞可能參與了對(duì)細(xì)胞因子的主要炎癥反應(yīng)筐乳。

最后歌殃，作者檢查了它們表達(dá)的時(shí)間變化（圖S4B 和 S4C）。盡管某些 IFN 反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子基因（例如STAT1和IRF3）隨著時(shí)間的推移趨于降低表達(dá)水平蝙云，但由于患者數(shù)量有限氓皱，這些模式均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將來(lái)有更多患者和更多時(shí)間點(diǎn)的研究將解決這個(gè)問(wèn)題勃刨。

討論

新興和再出現(xiàn)的病毒對(duì)人類健康構(gòu)成持續(xù)威脅（高波材，2018）。新的 SARS-CoV-2 病毒感染會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的肺部疾病和并發(fā)癥身隐，發(fā)病率和死亡率都很高廷区。當(dāng)前，沒(méi)有針對(duì)這種致命性肺病的最佳治療方法或有效藥物贾铝。作者目前對(duì)宿主對(duì) SARS-CoV-2 感染的免疫反應(yīng)的理解是有限的隙轻，這使得設(shè)計(jì)急需的新型療法變得困難。在這里垢揩，作者對(duì)來(lái)自 COVID-19 患者的 PBMC 進(jìn)行了 scRNA-seq玖绿。總體而言叁巨，SARS-CoV-2 的感染對(duì) PBMC 中免疫細(xì)胞的組成影響很小斑匪。在所有免疫細(xì)胞簇中，與健康對(duì)照組相比锋勺，所有五名 COVID-19 患者中漿細(xì)胞的百分比均顯著增加蚀瘸。漿細(xì)胞的這種增加可以產(chǎn)生多種保護(hù)性中和抗體。這些對(duì) SARS-CoV-2 的應(yīng)答產(chǎn)生的 B 細(xì)胞來(lái)源的抗體對(duì)于預(yù)防急性呼吸道感染導(dǎo)致的死亡以及為免受未來(lái)感染引起的疾病和/或死亡提供持續(xù)保護(hù)至關(guān)重要宙刘。另外苍姜，目前鼓勵(lì)包含來(lái)自康復(fù)患者的保護(hù)性中和抗體的血漿用于治療重癥患者。

在此過(guò)程中悬包，病毒感染可誘導(dǎo) IFN 發(fā)揮抗病毒功能并平衡病毒控制和免疫病理衙猪。在感染 SARS-CoV-2 的 ICU 患者中，血漿 IFNγ和TNF-α水平較高（Huang等布近，2020）垫释。IFNα2和IFNγ在COVID-19中也與肺損傷密切相關(guān)（Liu等人，2020年）撑瞧。此外棵譬，與健康對(duì)照組相比，僅在SARS-CoV-2感染的重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）患者中發(fā)現(xiàn)了共表達(dá)Th1細(xì)胞的IFNγ和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）共表達(dá)（Zhou等预伺，2020c） 订咸。一致地曼尊，在作者的研究中，“ IFN-I 反應(yīng)”豐富于 COVID-19 患者的不同 PBMC 亞群中脏嚷。此外骆撇，ISG 的表達(dá)包括ISG15，IFI44L父叙，與三個(gè)健康對(duì)照組相比神郊，這些患者中的MX1和XAF1顯著上調(diào)，表明 IFN 可能觸發(fā)了強(qiáng)大的抗病毒功能（Perng和Lenschow趾唱，2018年）涌乳。此外，與輕度和健康患者相比甜癞，重癥 COVID-19 患者對(duì) IFN 和病毒感染的反應(yīng)更強(qiáng)夕晓。這表明干擾素反應(yīng)的強(qiáng)度既可以指示 COVID-19 疾病的嚴(yán)重程度，又可以將 COVID-19 患者與健康個(gè)體區(qū)分開(kāi)悠咱。另外运授，IFN 應(yīng)答的動(dòng)力學(xué)表明個(gè)體差異，并表明針對(duì) SARS-CoV-2 感染的 IFN 治療的時(shí)機(jī)是關(guān)鍵的乔煞。

根據(jù)作者的結(jié)果吁朦，上調(diào)XAF1表達(dá)可能參與增加的 T 細(xì)胞凋亡 COVID-19 的患者中，與其它基因渡贾，包括配合IRF1逗宜，TP53，BCL2L11空骚，和CASP3（Jeong等人纺讲，2018。;囤屹。Zou等人熬甚，2012）。一致地肋坚，在另一項(xiàng) COVID-19 研究中乡括，COVID-19 患者的TP53表達(dá)增加（Xiong等，2020）智厌。除 XAF1 誘導(dǎo)的凋亡外诲泌，凋亡的外在途徑，包括 TNF-α/ TNFR1和Fas / FasL途徑（Elmore铣鹏，2007年））敷扫，也被發(fā)現(xiàn)與 COVID-19 患者的不同細(xì)胞亞型有關(guān)。此外诚卸，在作者的研究中葵第，據(jù)報(bào)道在嚴(yán)重的 COVID-19 病例中血漿 TNF-α升高（Chen等绘迁，2020；Huang等卒密，2020）脊髓，并且在本研究中 COVID-19 患者的 PBMC 中 TNF 的表達(dá)上調(diào)，證實(shí)了在 COVID-19 患者中 TNF-α分泌增加與TNF-α誘導(dǎo)的凋亡之間的相關(guān)性（Rath和Aggarwal栅受，1999年）。XAF1 可以被 TNF-α和IFN誘導(dǎo)恭朗，并作為T(mén)NF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的替代途徑（Strasszewski-Chavez等屏镊，2007）。XAF1 還被報(bào)道與 TNFSF10（TRAIL）共同促進(jìn)登革熱病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（Zhang等痰腮，2019）而芥。綜上所述，作者發(fā)現(xiàn)與 XAF1膀值，TNF 和 Fas 途徑相關(guān)的上調(diào)基因可能導(dǎo)致 COVID-19 患者的 T 細(xì)胞凋亡增加棍丐。

作者分析了細(xì)胞因子，細(xì)胞因子受體和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)沧踏，這些因子在病毒感染的免疫反應(yīng)中至關(guān)重要歌逢，并確定了與 IAV 患者不同的 COVID-19 患者的基因表達(dá)模式。細(xì)胞因子受體的上調(diào)與血清細(xì)胞因子水平的升高相一致翘狱，這可能會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)秘案。在 PBMC 中未檢測(cè)到大多數(shù)細(xì)胞因子的表達(dá)這一事實(shí)可能表明血清細(xì)胞因子主要來(lái)自感染部位，即 COVID-19 的下呼吸道潦匈。作者發(fā)現(xiàn)大多數(shù) COVID-19 患者的血漿 IL-6 濃度均高于正常水平阱高，與其他研究一致（Chen等人，2020年）茬缩。在 IAV 患者中也有 IL-6 升高的報(bào)道（Yu等人赤惊，2011），它是急性呼吸應(yīng)激綜合癥患者的免疫特征（Wang等人凰锡，2020c）未舟，與細(xì)胞因子釋放綜合癥導(dǎo)致的死亡率有關(guān)。目前掂为，已經(jīng)批準(zhǔn)了針對(duì)肺炎和 IL-6 升高的患者使用阻斷 IL-6 或 IL-6R 的治療方法]处面，并且一項(xiàng)小型研究表明，針對(duì) IL-6R 的單克隆抗體 Tocilizumab 可以緩解臨床癥狀（Xu et al菩掏。魂角，2020b）。作者的數(shù)據(jù)顯示智绸，在 COVID-19 患者中IL6R和IL6ST 的表達(dá)上調(diào)野揪，并且作者建議IL6R和IL6ST 的表達(dá)增加 可能與升高的 IL-6 協(xié)同作用以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)访忿，表明患者可能受益于 IL-6 或 IL-6R 拮抗劑治療。

研究的局限性

該研究的解釋存在重要局限性斯稳。

首先海铆，因?yàn)樵谧髡叩难芯恐袃H檢查了有限的患者，尤其是對(duì)于 IAV（兩名患者）挣惰，所以作者需要通過(guò)更大的臨床試驗(yàn)和/或進(jìn)一步的研究來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證在感染期間作者確定的 COVID-19 和 IAV 之間的差異卧斟。

第二，作者的研究集中于血液中 PBMC 的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組憎茂。如果作者可以將作者的數(shù)據(jù)與病變部位（例如肺）的數(shù)據(jù)結(jié)合起來(lái)珍语，作者的分析將更加系統(tǒng)化，因此結(jié)論將更加全面竖幔。

作者的研究在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組水平上觀察了與 IAV 患者相比板乙，COVID-19 患者在疾病過(guò)程中免疫反應(yīng)的動(dòng)態(tài)格局。這些結(jié)果不僅代表了 COVID-19 臨床過(guò)程中的免疫分子和細(xì)胞特征拳氢，而且還為診斷這種新疾病急需的生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)提供了途徑募逞。

數(shù)據(jù)和代碼可用性

原始和處理后的數(shù)據(jù)可在 CNGB 核苷酸序列檔案庫(kù)（CNSA：https: //db.cngb.org/cnsa）上獲得，登錄號(hào)為 CNP0001102馋评。支持當(dāng)前研究的代碼可應(yīng)要求從相應(yīng)的作者處獲得放接。

無(wú)監(jiān)督群集

細(xì)胞聚類由 Seurat（v3.1）R 工具箱（Butler et al。留特，2018）（https://github.com/satijalab/seurat）透乾。濾出少于 3 個(gè)細(xì)胞中表達(dá)的基因，排除檢測(cè)到少于 300 個(gè)或超過(guò) 6000 個(gè)基因的細(xì)胞磕秤。為了處理批處理效果乳乌，分別對(duì)每個(gè)樣本執(zhí)行了“ NormalizeData”和“ FindVariableGene”功能（n = 23）。之后市咆，使用“ FindIntergrationAnchors”和“ IntegrateData”函數(shù)將這 23 個(gè)批次集成在一起汉操，并將 dims 參數(shù)設(shè)置為 20。然后蒙兰，對(duì)集成數(shù)據(jù)集進(jìn)行縮放并計(jì)算 PCA磷瘤。首先使用 20 臺(tái) PC 來(lái)構(gòu)建 SNN 網(wǎng)絡(luò)，然后使用基于圖的聚類方法 louvain 算法來(lái)識(shí)別分辨率設(shè)置為 1 的細(xì)胞簇搜变。最后采缚，使用 UMAP 來(lái)可視化二維空間中的聚類結(jié)果。為了進(jìn)一步消除紅細(xì)胞的影響挠他，HBA1扳抽，HBA2，HBB，HBG1贸呢，HBG2镰烧，HBQ1，HBD楞陷，HBM怔鳖，HBE1和HBZ），并使用上述相同方法再次執(zhí)行聚類固蛾。

聚類標(biāo)記分析和細(xì)胞類型注釋

為了將每個(gè)簇注釋為特定的免疫細(xì)胞類型结执，作者為免疫細(xì)胞選擇了一些經(jīng)典標(biāo)記，并使用小提琴圖（圖1D）和 UMAP 特征圖（圖S1）來(lái)注釋細(xì)胞類型艾凯。以下基因用于細(xì)胞類型注釋：CD3G, CD4, CD8A, CD8B (T cells); KLRF1, XCL1 (NKs); MS4A1 (B cells); CD27 (Memory B cells) IGHG1, MZB1 (Plasma cells); CD68 (Monocytes); CD1C, LYZ (DCs); MKI67, TOP2A (Cycling cells); GZMA (Cytotoxic CD8+ T cells / NKs); CCR7, SELL (Naive T cells); PPBP (Megakaryocytes); CD34 (Stem cells).

差異表達(dá)基因（DEG）分析和 GO 富集

作者使用 Seurat R 軟件包中的“ FindMarkers”功能進(jìn)行了 DEG 分析献幔。作者比較的細(xì)胞群分別作為 ident.1 和 ident.2 輸入。計(jì)算所選細(xì)胞群之間基因平均表達(dá)水平的倍數(shù)變化览芳。為了找到上調(diào)基因的功能（調(diào)整后的 p <0.01，F(xiàn)oldchange> 2）鸿竖，作者使用了功能 compareCluster（fun =“ enrichGO”沧竟，pvalueCutoff = 0.1，pAdjustMethod =“ BH”缚忧，OrgDb =“ org.Hs.eg.db ChIPseeker R 軟件包（v.1.22.1）（Yu et al悟泵。，2015）闪水。

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文件 S1糕非。圖 S1-S4。

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表 S1球榆。入選受試者的臨床數(shù)據(jù)朽肥，與圖 1 相關(guān)。

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表 S2持钉。臨床實(shí)驗(yàn)室測(cè)試衡招，與圖 2 相關(guān)。

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表 S3每强。與圖 3 相關(guān)的疾病進(jìn)展階段信息始腾。

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文件 S2。文章加上補(bǔ)充信息空执。