著高（yan）端（hua）大（liao）氣（luan）嗎狂巢？想要右側(cè)這種結(jié)果來，你無須花費更多時間泞遗。
關(guān)于DNA-EMSA的前生今世
ps：老司機可以直接跳到下一板塊
用途：研究蛋白和DNA的特殊結(jié)合序列（比如轉(zhuǎn)錄因子和啟動子的特異結(jié)合殷蛇，再比如這個漫畫）
原理：結(jié)合蛋白的DNA由于分子量變大，在電泳時跑的慢残拐，那么如何檢測這個互作復(fù)合物？可以在DNA上加一面旗子碟嘴，這面旗子可以是放射性同位素溪食，可以是地高辛，也可以是生物素娜扇。
實驗流程：
圖.采用生物素檢測系統(tǒng)的DNA-EMSA實驗流程
如何證明結(jié)合特異性：對照實驗错沃。怎么設(shè)置對照呢？舉個例子就妥妥清楚了雀瓢。
圖中人物介紹
核蛋白提取物
三種DNA探針
特異結(jié)合的標(biāo)記探針—與核蛋白緊密結(jié)合枢析；
特異結(jié)合的未標(biāo)記探針—與標(biāo)記探針競爭結(jié)合，俗稱冷探針刃麸；
無關(guān)未標(biāo)記探針---“打醬油”DNA醒叁，不與核蛋白結(jié)合。
第一泳道—只有特異結(jié)合的標(biāo)記DNA泊业，放蕩不羈愛自由-跑到了最前面
第二泳道---在第一道基礎(chǔ)上把沼，加了核蛋白提取物，出現(xiàn)了“情侶擁抱”條帶吁伺，俗稱shift條帶
第三泳道—在第二道基礎(chǔ)上饮睬，加入過量搗亂DNA（競爭冷探針），它搶走大量目標(biāo)蛋白篮奄，由于沒帶標(biāo)記捆愁，“情侶擁抱”條帶變淡割去，甚至消失
第四泳道—加入無關(guān)未標(biāo)記探針，坐視不理核蛋白抽提物昼丑，結(jié)合條帶再次出現(xiàn)
這證明了什么呻逆？（記幾想。想不通找小編菩帝。）
關(guān)于DNA-EMSA常見問題
之基礎(chǔ)篇
1）需要準(zhǔn)備哪些材料页慷，就可以開始DNA-EMSA了？
核蛋白提取物胁附，標(biāo)記探針，未標(biāo)記探針滓彰，未標(biāo)記無關(guān)探針控妻，非變性電泳凝膠，尼龍膜揭绑，檢測系統(tǒng)
2）如果要開始實驗弓候，我還需要考慮哪些點？
可以從檢測體系他匪、結(jié)合蛋白菇存、探針標(biāo)記、電泳轉(zhuǎn)膜這幾個方面優(yōu)先入手邦蜜。（下方將逐項展開）
檢測體系
三種檢測系統(tǒng)：放射性同位素依鸥、地高辛、生物素有何區(qū)別悼沈，選擇哪種比較好贱迟？
檢測靈敏度：放射性同位素≈生物素＞地高辛
安全性：生物素≈地高辛＞放射性同位素
至于選擇哪種，還要綜合考慮實驗室情況和使用習(xí)慣絮供。
結(jié)合蛋白篇
我的蛋白豐度低衣吠，能做出實驗來嗎？
實驗體系的靈敏度夠壤靶，理論上是可以的缚俏。建議富集靶標(biāo)區(qū)域蛋白，比如專門富集核蛋白（DNA主要在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生調(diào)控）實驗結(jié)果會更明顯
蛋白添加量多少比較好贮乳？
Thermo Scientific生物素系統(tǒng)EMSA忧换，建議蛋白添加量2-5ug。
核蛋白濃度較低向拆，上樣前如何定量包雀？
建議使用microBCA（檢測范圍0.5-20ug/mL），低濃度定量更準(zhǔn)確亲铡。
探針標(biāo)記篇
探針如何標(biāo)記（直接合成還是自己標(biāo)記）才写？
建議11-30bp的DNA探針可直接合成標(biāo)記生物素葡兑，價格合適。堿基長度過長的DNA探針建議采用試劑盒進(jìn)行標(biāo)記赞草，更劃算讹堤。
由于DNA探針生物素標(biāo)記采用TdT末端轉(zhuǎn)移酶，此酶單鏈標(biāo)記效率更高厨疙，可將DNA雙鏈熱變性洲守，標(biāo)記后退火即可。核酸互補鏈的退火方法有很多沾凄，參見技術(shù)貼士45：“寡核苷酸互補對的退火”梗醇，有詳細(xì)的操作步驟。
如何檢探針的標(biāo)記效率撒蟀？
斑點雜交叙谨。#89818說明書中有詳細(xì)protocol可供參考。
探針長度有限制嗎保屯？
通常EMSA實驗的DNA長度為20-35bp手负，我們成功檢測過60bp長度的DNA。實際上蛋白與DNA binding的長度為10-15bp姑尺，如果binding的序列未知或者有多個調(diào)控區(qū)域竟终，也可嘗試更長的探針，但是長探針也會增加非特異性結(jié)合的風(fēng)險切蟋。
電泳轉(zhuǎn)膜篇
使用瓊脂糖膠统捶，還是必須用聚丙烯酰胺膠？
這兩種膠都可以用在EMSA實驗上柄粹，具體采用那種瘾境，要看實驗對分辨率的需求。傳統(tǒng)上使用4%-6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠镰惦，毛細(xì)管轉(zhuǎn)印或者電轉(zhuǎn)都可以迷守。如果使用瓊脂糖凝膠，毛細(xì)管轉(zhuǎn)印更推薦旺入。
為何要預(yù)電泳兑凿？
上樣前，建議聚丙烯酰胺凝膠通電預(yù)跑30-60min茵瘾，除掉膠中影響互作的雜質(zhì)礼华。
選用哪種膜？
正電尼龍膜拗秘。
