首先解釋一下窑滞，為什么要分析灰度值毡证？

灰度的概念是使用黑色調表示物體电爹，即用黑色為基準色，不同的飽和度的黑色來顯示圖像料睛。采用ECL發(fā)光時丐箩，蛋白條帶發(fā)出的熒光會曝光在膠片上，留下的黑色條帶恤煞。然而膠片掃描后為藍色背景屎勘、黑色條帶，這并不是單純的黑灰白顏色居扒。因此概漱，我們首先得在Photoshop中將整張圖片去色，使彩色圖片變成黑白圖片喜喂，形成近灰色背景犀概、黑色條帶的圖片類型。此時夜惭，條帶的深淺和面積綜合代表著蛋白的量姻灶。灰度值分析自然就成為我們的首選诈茧。

延伸說一下产喉，免疫組織化學染色(IHC)結果本身為近白色背景、棕黃色陽性表達敢会，這時我們就不能直接用灰度反映陽性表達強弱了曾沈，而是積分吸光度，也就是咱們常說的平均光密度(IOD)鸥昏。如果你真的想用灰度計算IHC結果塞俱，顯然你需要將圖片轉為灰度圖再計算。此處不表吏垮。

分析圖文步驟如下：

Image J軟件界面 ↓

1. 圖片轉換為黑白圖：

首先使用Photoshop打開膠片掃描圖片障涯，點擊“圖像>調整>去色”罐旗，將彩色圖片轉化為黑白圖片，并使用裁剪工具將目標條帶裁剪至合適大小后另存圖片唯蝶。

2.打開Image J軟件：

2.1.打開圖片文件：File>Open九秀；將圖片轉化為8bit類型：Image>Type>8-bit。

(此步驟的目的是為了將圖片的每個像素用8bit表示粘我，這樣的話鼓蜒，整個圖片的灰度將分為256個級別，即黑征字、灰都弹、白的像素模式；若保留原始的16bit格式或RGB格式匙姜，圖片灰度級別會呈指數增長畅厢，并有其它顏色混入，造成計算誤差搁料。)

2.2.將整張圖片背景灰度均一化，消除圖片背景影響：

Process>Subtract Background系羞，默認數值為50即可郭计。

2.3將圖片黑白顏色反轉。

使背景為黑色而條帶為白色椒振。既還原了條帶發(fā)光時的樣子昭伸，也方便我們后面圈選條帶：Edit>Invert。

2.4設置從測量指標：

Analyze>Set Measurements澎迎，選擇Area面積庐杨、平均灰度值Mean gray value、積分灰度值Integrated dendity夹供。

(解釋一下灵份，我們最終要使用的值為積分灰度Integrated dendity，而不是平均密度值Mean gray value哮洽。因為平均灰度僅是選定區(qū)域的平均灰度數值填渠，而積分密度值則加權了平均灰度和選定的面積，這樣選擇就消除了選定面積大小對灰度值的影響鸟辅。希望大家能好好理解這一概念氛什，未來小編講到IHC測量時將詳細說明。)

2.5設置測量單位為“單個像素”：

Analyze>Set Scale匪凉，將Unit of length中的inch改為pixels枪眉。

2.6選定需要測量的條帶，并測量積分光密度：

使用矩形選框再层、橢圓形選框或手動繪制選框(手殘黨勿用)贸铜，將面積最大的條帶完全圈住堡纬，快捷鍵Ctrl+m測量，彈出Results結果框萨脑，結果中的IntDen即積分灰度值隐轩；繼續(xù)左鍵點擊選定框中間，不要點框線(否則選定框的大小會改變渤早，要保證框選范圍一致)职车，拖動選定框并移動至其它條帶，快捷鍵Ctrl+m測量鹊杖；重復操作至所有條帶測完悴灵，最后不要忘了在圖片無條帶位置加測背景的灰度。

2.7測量結束后骂蓖，點擊Results框中的Edit积瞒，選擇Select All，粘貼至Excel登下，開始下一步的分析茫孔。

2.8積分灰度值的計算和標準化

首先，將所有條帶的IntDen都減去圖片背景的IntDen被芳，以扣除背景影響缰贝；然后用目標蛋白的灰度值除以其對應泳道的內參照條帶灰度值，以此作為該組的目標蛋白相對表達量A畔濒。

標準化方法1：如果你是用一張膜來統計剩晴，那么直接用所有組的A值除以對照組A值，此時對照組結果為1侵状，其它組結果為對照組的倍數赞弥，以此做均一化。

標準化方法2：如果你是用2張或以上的膜來一起統計趣兄，那么首先計算所有膜上的對照組A的平均值A’绽左，然后用其它組的A值除以A’，以此做均一化艇潭。這種方法的前提是不同膜之間的背景顏色要相近妇菱，若偏差大則數據會很亂。

事實上暴区，還有一種采用波峰下面積分析條帶的方法闯团。即通過半自動描繪電泳條帶的等高線邊緣來得到等高線區(qū)域內部面積，再將該面積乘以區(qū)域內平均光密度值得到條帶內部總的信號量仙粱。這種計算方法可在Image J或者Quantity One上實現房交。但是有人注意到此法的缺陷，故小編沒有具體說明這種測量方法伐割。附上鏈接候味，有興趣的同志們可以看看刃唤。

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