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還有 系統(tǒng)的使用affy處理芯片望几，看原貼：

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1. 快速入門

安裝并加載所需R包

source("http://bioconductor.org/biocLite.R");

biocLite(“CLL”)

# 載入CLL包棘幸，CLL包會自動調(diào)用affy包傅物，該包含有一系列處理函數(shù)

library(CLL)# read example dataset，（CLL包附帶的示例數(shù)據(jù)集）data("CLLbatch")# pre-process using RMA methodCLLrma<- rma(CLLbatch)# read expression value after pre-processinge <- exprs(CLLrma)# 查看部分?jǐn)?shù)據(jù)e[1:5,1:5]

image.png

2. 基因芯片數(shù)據(jù)預(yù)處理

2.1 數(shù)據(jù)輸入

# 載入CLL包翰绊，CLL包會自動調(diào)用affy包迅诬，該包含有一系列處理函數(shù)library(CLL)# read example dataset腋逆，（CLL包附帶的示例數(shù)據(jù)集）data("CLLbatch")# 查看數(shù)據(jù)類型data.class(CLLbatch)# 讀入所有樣本的狀態(tài)信息data(disease)# 查看所有樣本的狀態(tài)信息disease

image.png

# 查看"AffyBatch"的詳細(xì)介紹help(AffyBatch)phenoData(CLLbatch)featureData(CLLbatch)protocolData(CLLbatch)annotation(CLLbatch)exprs_matrix <- assayData(CLLbatch)[[1]]exprs_matrix[1:5,1:5]exprs(CLLbatch)[1:5,1:5]

image.png

2.2 質(zhì)量控制

質(zhì)量控制分三步，直觀觀察侈贷，平均值方法惩歉，數(shù)據(jù)擬合方法。這三個(gè)層次的質(zhì)量控制分別由image 函數(shù)俏蛮、simpleaffy 包和affyPLM包實(shí)現(xiàn)

2.2.1 用image包對芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評估

# 查看第一張芯片的灰度圖像image(CLLbatch[,1])

如果圖像特別黑撑蚌，說明型號強(qiáng)度低；如果圖像特別亮搏屑，說明信號強(qiáng)度很有可能過飽和

image.png

2.2.2 用simpleaffy包對芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評估

# 安裝simpleaffy包source('http://Bioconductor.org/biocLite.R')biocLite("simpleaffy")library(BiocInstaller)biocLite("simpleaffy")library(simpleaffy)library(CLL)data(CLLbatch)# 獲取質(zhì)量分析報(bào)告Data.qc <- qc(CLLbatch)# 圖型化顯示報(bào)告plot(Data.qc)

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第一列是所有樣品的名稱

第二列檢出率和平均背景噪聲（往往較高的平均背景噪聲都伴隨著較低的檢出率）

第三列

藍(lán)色實(shí)現(xiàn)為尺度因子争涌，取值（-3，3）

"o" 不能超過1.25辣恋，否則數(shù)據(jù)質(zhì)量不好

“三角型“不能超過3亮垫，否則數(shù)據(jù)質(zhì)量不好

bioB 說明芯片檢測沒有達(dá)標(biāo)

2.2.3 用affyPLM包對芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評估

source('http://Bioconductor.org/biocLite.R')biocLite('affyPLM')library(affyPLM)data(CLLbatch)# 對數(shù)據(jù)集做回歸分析模软，結(jié)果為一個(gè)PLMset類型的對象Pset <- fitPLM(CLLbatch)image(CLLbatch[,1])# 根據(jù)計(jì)算結(jié)果，畫權(quán)重圖image(Pset,type="weights",which=1, main="Weights")# 根據(jù)計(jì)算結(jié)果饮潦，畫殘差圖image(Pset,type="resids",which=1, main="Residuals")# 根據(jù)計(jì)算結(jié)果燃异，畫殘差符號圖image(Pset,type="sign.resids",which=1, main="Residuals.sign")

image.png

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2.2.4 查看總體質(zhì)量

一個(gè)樣品的所有探針組的RLE分布可以用一個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)中常用的箱型圖形表示

source('http://Bioconductor.org/biocLite.R')biocLite("RColorBrewer")library(affyPLM)library(RColorBrewer)library(CLL)# 讀入數(shù)據(jù)data("CLLbatch")# 對數(shù)據(jù)集做回歸計(jì)算Psel<-fitPLM(CLLbatch)# 載入一組顏色colors<-brewer.pal(12,"Set3")# 繪制RLE箱線圖Mbox(Pset, ylim=c(-1,1),col=colors,main="RLE",las=3);# 繪制NUSE箱線圖boxplot(Pset,ylim=c(0.95,1.22),col=colors,main="NUSE",las=3)

從以下兩幅圖中可以看出CLL1，CLL10 的質(zhì)量明顯有別與其他樣品继蜡，需要去除

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2.2.5 查看RNA降解曲線

source('http://Bioconductor.org/biocLite.R')biocLite("affy")library(affy)library(RColorBrewer)library(CLL)data("CLLbatch")# 獲取降解數(shù)據(jù)data.deg <- AffyRNAdeg(CLLbatch)# 載入一組顏色colors <- brewer.pal(12,"Set3")# 繪制RNA降解圖plotAffyRNAdeg(data.deg, col=colors)# 在左上部位加注圖注legend("topleft", rownames(pData(CLLbatch)), col=colors, lwd=1, inset=0.05, cex=0.5)

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去掉三個(gè)質(zhì)量差的

CLLbatch<-CLLbatch[, -match(c("CLL10.CEL","CLL1.CEL","CLL13.CEL"),? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? sampleNames(CLLbatch))]

2.2.6 從聚類分析的角度看數(shù)據(jù)質(zhì)量

source('http://Bioconductor.org/biocLite.R')biocLite("gcrma")biocLite("graph")biocLite("affycoretools")library(CLL)library(gcrma)library(graph)library(affycoretools)data(CLLbatch)data("disease")# 使用gcrma算法來預(yù)處理數(shù)據(jù)CLLgcrma<-gcrma(CLLbatch)# 提取基因表達(dá)矩陣eset<-exprs(CLLgcrma)# 計(jì)算樣品兩兩之間的Pearson相關(guān)系數(shù)pearson_cor<-cor(eset)# 得到Pearson距離的下三角矩陣dist.lower<-as.dist(1-pearson_cor)# 聚類分析hc<-hclust(dist.lower,"ave")plot(hc)# PCA分析samplenames<-sub(pattern="\\.CEL", replacement ="",colnames(eset))groups<-factor(disease[,2])plotPCA(eset,addtext=samplenames,groups=groups,groupnames=levels(groups))

從聚類分析的結(jié)果來看回俐，穩(wěn)定組（紅框）和惡化組分不開

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從主成成份分析來看，也分不開

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2.3 背景校正稀并、標(biāo)準(zhǔn)化和匯總

芯片數(shù)據(jù)通過質(zhì)量控制仅颇，剔除不合格的樣品，留下的樣品數(shù)據(jù)往往要通過三步處理（背景校正稻轨、標(biāo)準(zhǔn)化和匯總）才能得到下一步分析所需要的基因表達(dá)矩陣

去除背景噪聲的過程叫背景校正

標(biāo)準(zhǔn)化目的是使各次/組測量或各種實(shí)驗(yàn)條件下的測量可以相互比較

使用一定的統(tǒng)計(jì)方法將前面得到的熒光強(qiáng)度值從探針?biāo)絽R總到探針組水平

> bgcorrect.methods()[1]"bg.correct""mas""none""rma"> normalize.methods(CLLbatch) [1]"constant""contrasts""invariantset""loess""methods""qspline"[7]"quantiles""quantiles.robust""quantiles.probeset""scaling"> pmcorrect.methods()[1]"mas""methods""pmonly""subtractmm"> express.summary.stat.methods()[1]"avgdiff""liwong""mas""medianpolish""playerout"

參數(shù)說明

afbatch輸入數(shù)據(jù)的類型必須是AffyBatch對象

bgcorrect.method背景校正方法

bgcorrect.param指定背景校正方法的參數(shù)

normalize.method標(biāo)準(zhǔn)化方法

normalize.param指定標(biāo)準(zhǔn)化方法的參數(shù)

pmcorrect.methodPM調(diào)整方法

pmcorrect.param指定PM方法參數(shù)

summary.method匯總方法

summary.param指定匯總方法的參數(shù)

芯片內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)化（Loess）前后MA圖

# 使用mas方法做背景校正>CLLmas5<- bg.correct(CLLbatch, method ="mas")# 使用constant方法標(biāo)準(zhǔn)化> data_mas5 <- normalize(CLLmas5, method="constant")#　查看每個(gè)樣品的縮放系數(shù)> head(pm(data_mas5)/pm(CLLmas5),5)CLL11.CELCLL12.CELCLL14.CELCLL15.CELCLL16.CELCLL17.CELCLL18.CELCLL19.CELCLL20.CELCLL21.CELCLL22.CELCLL23.CEL17521811.1558491.0238731.4931931.5493692.0002991.4515761.7765010.98251080.70708280.99587331.43236535668911.1558491.0238731.4931931.5493692.0002991.4515761.7765010.98251080.70708280.99587331.43236522769611.1558491.0238731.4931931.5493692.0002991.4515761.7765010.98251080.70708280.99587331.43236523791911.1558491.0238731.4931931.5493692.0002991.4515761.7765010.98251080.70708280.99587331.43236527517311.1558491.0238731.4931931.5493692.0002991.4515761.7765010.98251080.70708280.99587331.432365CLL24.CELCLL2.CELCLL3.CELCLL4.CELCLL5.CELCLL6.CELCLL7.CELCLL8.CELCLL9.CEL1752181.7060261.1563780.84254190.97750820.98165731.1829631.1149761.136390.89392483566891.7060261.1563780.84254190.97750820.98165731.1829631.1149761.136390.89392482276961.7060261.1563780.84254190.97750820.98165731.1829631.1149761.136390.89392482379191.7060261.1563780.84254190.97750820.98165731.1829631.1149761.136390.89392482751731.7060261.1563780.84254190.97750820.98165731.1829631.1149761.136390.8939248# 查看第二個(gè)樣品的縮放系數(shù)是怎么計(jì)算來的> mean(intensity(CLLmas5)[,1])/mean(intensity(CLLmas5)[,2])[1]1.155849

2.4 預(yù)處理的一體化算法

預(yù)處理方法

方法背景校正方法標(biāo)準(zhǔn)化方法匯總方法

MASSmasconstantmas

dChipmasinvariantsetliwong

RMArmaquantilemedianpolish

MAS5 每個(gè)芯片可以單獨(dú)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化灵莲；RMA 采用多芯片模型雕凹，需要對所有芯片一起進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化殴俱。

MAS5 利用MM探針的信息去除背景噪聲，基本思路是MP-MM枚抵；RMA 不使用MM信息线欲，而是基于PM信號分布采用的隨機(jī)模型來估計(jì)表達(dá)值。

RMA處理后的數(shù)據(jù)是經(jīng)過2為底的對數(shù)轉(zhuǎn)換的汽摹，而MAS5不是李丰，這一點(diǎn)非常重要，因?yàn)榇蠖鄶?shù)芯片分析軟件和函數(shù)的輸入數(shù)據(jù)必須經(jīng)過對數(shù)變換逼泣。

比較不同算法的處理效果

library(affy)library(gcrma)library(affyPLM)library(RColorBrewer)library(CLL)data("CLLbatch")colors <- brewer.pal(12,"Set3")# use MAS5CLLmas5<- mas5(CLLbatch)# use rma CLLrma<- rma(CLLbatch)# use gcrmaCLLgcrma<- gcrma(CLLbatch)## hist plothist(CLLbatch, main="orignal", col=colors)legend("topright", rownames(pData(CLLbatch)), col=colors,? ? ? lwd=1, inset=0.05, cex=0.5, ncol=3)hist(CLLmas5, main="MAS 5.0", xlim=c(-150,2^10), col=colors)hist(CLLrma, main="RMA", col=colors)hist(CLLgcrma, main="gcRMA", col=colors)## boxplotboxplot(CLLbatch, col=colors, las=3, main="original")boxplot(CLLmas5, col=colors, las=3, ylim=c(0,1000), main="MAS 5.0")boxplot(CLLrma, col=colors, las=3, main="RMA")boxplot(CLLgcrma, col=colors, las=3, main="gcRMA")

RMA算法將多條曲線重合到了一起趴泌，有利于進(jìn)一步的差異分析，但卻出現(xiàn)了雙峰現(xiàn)象拉庶，不符合高斯正態(tài)分布嗜憔。很顯然gcRMA算法在這里表現(xiàn)的更好。

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三個(gè)算法處理后的各樣品的中值都十分接近氏仗。MAS5算法總體而言還不錯(cuò)吉捶，有一定拖尾現(xiàn)象；而gcRMA的拖尾現(xiàn)象比RMA要明顯得多皆尔。這說明針對低表達(dá)量的基因呐舔，RMA算法比gcRMA算法表現(xiàn)更好一些。

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通過MA圖來查看標(biāo)準(zhǔn)化處理的效

library(gcrma)library(RColorBrewer)library(CLL)library(affy)data("CLLbatch")colors<-brewer.pal(12."Set3")CLLgcrma<-gcrma(CLLbatch)MAplot(CLLbatch[,1:4],pairs=TRUE,plot.method="smoothScatter",cex=0.8,main="original MA plot")MAplot(CLLgcrma[,1:4],pairs=TRUE,plot.method="smoothScatter",cex=0.8,main="gcRMA MA plot")

原始數(shù)據(jù)中慷蠕，中值（紅線）偏離0珊拼，經(jīng)過gcRMA處理后，中值基本保持在零線上流炕。

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3 基因芯片數(shù)據(jù)分析

3.1 選取差異表達(dá)基因

######## DEG analysis#　如果沒有安裝limma包杆麸，請取消下面兩行注釋# library(BiocInstaller)# biocLite("limma")# 導(dǎo)入包library(limma)library(gcrma)library(CLL)# 導(dǎo)入CLL數(shù)據(jù)data("CLLbatch")data(disease)# 移除 CLL1, CLL10, CLL13CLLbatch<-CLLbatch[, -match(c("CLL10.CEL","CLL1.CEL","CLL13.CEL"),? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? sampleNames(CLLbatch))]# 用gcRMA算法進(jìn)行預(yù)處理CLLgcrma<- gcrma(CLLbatch)# remove .CEL in sample namessampleNames(CLLgcrma) <- gsub(".CEL$","", sampleNames(CLLgcrma))# remove record in data disease about CLL1, 10 and 13.CELdisease <- disease[match(sampleNames(CLLgcrma), disease[,"SampleID"]), ]# 獲得余下21個(gè)樣品的基因表達(dá)矩陣eset <- exprs(CLLgcrma)# 提取實(shí)驗(yàn)條件信息disease <- factor(disease[,"Disease"])# 構(gòu)建實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)矩陣design <- model.matrix(~-1+disease)# 構(gòu)建對比模型搁进，比較兩個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下表達(dá)數(shù)據(jù)#　這里的.是簡寫而不是運(yùn)算符號contrast.matrix <- makeContrasts(contrasts ="diseaseprogres. - diseasestable",? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? levels=design)# 線性模型擬合fit <- lmFit(eset, design)# 根據(jù)對比模型進(jìn)行差值計(jì)算 fit1 <- contrasts.fit(fit, contrast.matrix)# 貝葉斯檢驗(yàn)fit2 <- eBayes(fit1)# 生成所有基因的檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告dif <- topTable(fit2, coef="diseaseprogres. - diseasestable", n=nrow(fit2), lfc=log2(1.5))# 用P.Value進(jìn)行篩選，得到全部差異表達(dá)基因dif <- dif[dif[,"P.Value"]<0.01,]# 顯示一部分報(bào)告結(jié)果head(dif)

>head(dif)logFCAveExprtP.Valueadj.P.ValB39400_at-0.99978505.634004-5.7273291.482860e-050.10345442.44583541303_at-1.34303064.540225-5.5968131.974284e-050.10345442.154635033791_at1.96479626.8379035.4004993.047498e-050.10345441.713558336131_at0.95742149.9453345.3677413.277762e-050.10345441.639622337636_at2.05340935.4786835.1205195.699454e-050.14391121.078831336122_at0.80086047.1462934.7767211.241402e-040.26121180.2922106

下面逐次介紹這個(gè)分析過程的六個(gè)關(guān)鍵步驟：構(gòu)建基因表達(dá)矩陣昔头、構(gòu)建實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)矩陣饼问、構(gòu)建對比模型（對比矩陣）、線性模型擬合揭斧、貝葉斯檢驗(yàn)和生成結(jié)果報(bào)表莱革。

design

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3.2 注釋

# 加載注釋工具包library(annotate)# 獲得基因芯片注釋包名稱affydb <- annPkgName(CLLbatch@annotation,type="db")affydb# 如果沒有安裝，先安裝biocLite(affydb)#　加載該包library(affydb, character.only = TRUE)# 根據(jù)每個(gè)探針組的ID獲取對應(yīng)基因Gene Symbol讹开，并作為新的一列dif$symbols<- getSYMBOL(rownames(dif), affydb)# 根據(jù)探針I(yè)D獲取對應(yīng)基因Entrez IDdif$EntrezID<- getEG(rownames(dif), affydb)# 顯示前幾行head(dif)

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3.3 統(tǒng)計(jì)分析及可視化

# 加載包library(GOstats)# 提取HG_U95Av2芯片中所有探針組對應(yīng)的EntrezID盅视，注意保證uniqentrezUniverse <- unique(unlist(mget(rownames(eset), hgu95av2ENTREZID)))# 提取差異表達(dá)基因及其對應(yīng)的EntrezIDentrezSelected <- unique(dif[!is.na(dif$EntrezID),"EntrezID"])# 設(shè)置GO富集分析的所有參數(shù)params <-new("GOHyperGParams", geneIds=entrezSelected, universeGeneIds=entrezUniverse,? ? ? ? ? ? ? annotation=affydb, ontology="BP", pvalueCutoff=0.001, conditional=FALSE,? ? ? ? ? ? ? testDirection="over")# 對所有的GOterm根據(jù)params參數(shù)做超幾何檢驗(yàn)hgOver <- hyperGTest(params)# 生成所有GOterm的檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)表bp <- summary(hgOver)# 同時(shí)生成所有GOterm的檢驗(yàn)結(jié)果文件，每個(gè)GOterm都有指向官方網(wǎng)站的鏈接旦万，以獲得詳細(xì)信息htmlReport(hgOver, file="ALL_go.html")# 顯示結(jié)果前幾行head(bp)

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# 安裝并加載所需包biocLite("GeneAnswers")library(GeneAnswers)# 選取dif中的三列信息構(gòu)成新的矩陣闹击，新一列必須是EntrezIDhumanGeneInput <- dif[, c("EntrezID","logFC","P.Value")]# 獲得humanGeneInput中基因的表達(dá)值humanExpr <- eset[match(rownames(dif), rownames(eset)), ]humanExpr <- cbind(humanGeneInput[,"EntrezID"], humanExpr)# 去除NA數(shù)據(jù)humanGeneInput <- humanGeneInput[!is.na(humanGeneInput[,1]),]humanExpr <- humanExpr[!is.na(humanExpr[,1]),]# KEGG通路的超幾何檢驗(yàn)y <- geneAnswersBuilder(humanGeneInput,"org.Hs.eg.db", categoryType ="KEGG",? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? testType ="hyperG", pvalueT=0.1, geneExpressionProfile=humanExpr,? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? verbose = FALSE)getEnrichmentInfo(y)[1:6]

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biocLite("pheatmap")library(pheatmap)# 從基因表達(dá)矩陣中，選取差異表達(dá)基因?qū)?yīng)的數(shù)據(jù)selected <- eset[rownames(dif), ]# 將selected矩陣每行的名稱由探針組ID轉(zhuǎn)換為對應(yīng)的基因symbolrownames(selected) <- dif$symbols# 考慮顯示問題成艘，這里只畫前20個(gè)基因的熱圖pheatmap(selected[1:20,], color = colorRampPalette(c("green","black","red"))(100),? ? ? ? fontsize_row = 4, scale ="row", border_color = NA)

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biocLite("Rgraphviz")library(Rgraphviz)# 顯著富集的GO term的DAG關(guān)系圖ghandle <- goDag(hgOver)# 這個(gè)圖太大赏半，這里只能選一部分?jǐn)?shù)據(jù)構(gòu)建局部圖subGHandle <- subGraph(snodes=as.character(summary(hgOver)[,1]), graph = ghandle)plot(subGHandle)

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source("https://bioconductor.org/biocLite.R")biocLite("KEGG.db")yy<- geneAnswersReadable(y)geneAnswersConceptNet(yy, colorValueColumn ="logFC", centroidSize ="pvalue", output="interactive")

這里我報(bào)錯(cuò)了，這個(gè)網(wǎng)站解決問題http://planspace.org/2013/01/17/fix-r-tcltk-dependency-problem-on-mac/

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yyy<- geneAnswersSort(yy,sortBy ="pvalue")geneAnswersHeatmap(yyy)

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最后輸出會話信息：

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參考文獻(xiàn)

http://www.flypeom.site/bioinformatics/r/2017/10/09/microArray-data-analysis/

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作者：thinkando

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來源：簡書

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