關(guān)于inducible knockout system密幔，原先花了超過(guò)12個(gè)小時(shí)看了一篇相關(guān)文獻(xiàn)并做了PPT弦讽，結(jié)合所掌握的背景知識(shí)忙芒，對(duì)這個(gè)實(shí)驗(yàn)方案模模糊糊了解了一些磕道。以下是我簡(jiǎn)單記錄自己從零基礎(chǔ)開始學(xué)習(xí)分子克隆基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的過(guò)程供屉。
想要開始學(xué)習(xí)并能實(shí)施這樣的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，需要掌握以下：
背景知識(shí)學(xué)習(xí)：
Cre-LoxP條件性基因編輯系統(tǒng)--學(xué)習(xí)筆記
FLP-FRT系統(tǒng)--誘導(dǎo)性基因編輯inducible gene editing
解剖式學(xué)習(xí)一個(gè)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)--做知識(shí)的搬運(yùn)工
Gibson Assembly 學(xué)習(xí)筆記--做知識(shí)的搬運(yùn)工
還需要補(bǔ)充：（我并沒(méi)有整理這部分資料寫出來(lái)）
Tet-on/off系統(tǒng)
如何設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增DNA片段的引物（使用SnapGene軟件）
本周做的事情就是載體構(gòu)建
準(zhǔn)備工作
- 供體質(zhì)粒若干：用于vector提取溺蕉，用于PCR擴(kuò)增DNAfragment伶丐；
- 常用的限制性內(nèi)切酶；
- 感受態(tài)細(xì)胞疯特；
- 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化哗魂、擴(kuò)增等相關(guān)基本技術(shù)和材料；
- 膠回收試劑盒漓雅、質(zhì)粒提取試劑盒等录别。
Step 1 準(zhǔn)備所需載體+PCR擴(kuò)增DNA片段
（1）通過(guò)酶切方式，將不需要的片段切下邻吞，通過(guò)凝膠電泳分離出所需的vector组题，并使用膠回收試劑盒回收vector。
這部分用到的protocol主要參考限制性內(nèi)切酶說(shuō)明書+膠回收試劑盒說(shuō)明書吃衅。
（2）前期通過(guò)SnapGene上的Gibson Assembly工具事先算好質(zhì)粒構(gòu)建的路線方針（嘻嘻）往踢，所以引物是提前設(shè)計(jì)好了，并找了生物公司合成徘层。找到含有目的DNA片段的質(zhì)粒峻呕，使用Q5高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增出目的片段利职，凝膠電泳膠回收該DNA片段。
這一步使用到的protocol瘦癌，就是Gibson Assembly設(shè)計(jì)教程及Q5 PCR的protocol猪贪。
Step 2 Gibson Assembly實(shí)驗(yàn)
參照自己買的Gibson Assembly試劑盒的說(shuō)明書即可~
https://international.neb.com/applications/cloning-and-synthetic-biology/dna-assembly-and-cloning/gibson-assembly
Step 3 Gibson Assembly產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增并提取質(zhì)粒
（1）將Gibson Assembly轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中讯私，復(fù)蘇成功后涂帶篩選功能（如抗生素抗性）的平板热押，12-16小時(shí)候挑克隆進(jìn)行擴(kuò)增12-16小時(shí)。
（2）取菌液200 μl斤寇，99攝氏度破裂15 min后桶癣，4000 rpm離心5 min后，取2 μl上清用作PCR模板娘锁，使用Step 1中第（2）步的DNA擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR反應(yīng)牙寞，檢測(cè)是否已經(jīng)插入該片段，此時(shí)使用Taq DNA聚合酶寄即可莫秆。
（3）菌液提取質(zhì)粒之后间雀，使用酶切實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證是否插入相應(yīng)DNA片段（好好挑酶切位點(diǎn)），瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證產(chǎn)物分子量大小镊屎。
這部分使用到的protocol：質(zhì)粒轉(zhuǎn)化惹挟、Taq DNA聚合酶PCR、質(zhì)粒提取缝驳、酶切實(shí)驗(yàn)连锯。
Step 4 測(cè)序驗(yàn)證。
最終還是要靠測(cè)序驗(yàn)證的党巾。
不只是一步
有些質(zhì)粒構(gòu)建的過(guò)程比較復(fù)雜萎庭，不只是一次Gibson Assembly就可以的。有時(shí)候可能要結(jié)合Golden Gate之類的方法齿拂。
抽空寫了20分鐘驳规，并沒(méi)有回頭檢查錯(cuò)別字，敬請(qǐng)包涵署海，休息好了~繼續(xù)干活去吗购，加油！
（PS：為什么這么簡(jiǎn)單的一個(gè)推文砸狞，非要寫出來(lái)捻勉？其實(shí)當(dāng)我零基礎(chǔ)的時(shí)候，我甚至不知道什么是質(zhì)粒刀森，所以這篇推文里面的幾乎所有的實(shí)驗(yàn)還有背景知識(shí)都是現(xiàn)學(xué)現(xiàn)用的踱启，所以我還是堅(jiān)持把自己完成一個(gè)事情所需要做的所有的事情都相應(yīng)記錄下來(lái)，希望能對(duì)其他人有所幫助。盡管補(bǔ)充了理論知識(shí)埠偿，實(shí)際實(shí)驗(yàn)過(guò)程中還是會(huì)遇到非常多的細(xì)節(jié)問(wèn)題透罢，都是遇到一個(gè)解決一個(gè)的，前路且長(zhǎng)冠蒋，慢慢走吧羽圃。）
