Western Blot（WB）胳螟，蛋白免疫印跡法昔馋，一句話，定性糖耸、定量檢測蛋白表達的一種經(jīng)典秘遏、有效的技術(shù)方法。

將電泳分離的細胞或組織蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上嘉竟，用特定抗體結(jié)合蛋白抗原邦危，再結(jié)合標記的二抗，以化學發(fā)光的方式可視化地將蛋白表達情況呈現(xiàn)在人們面前舍扰，是幾乎每一位生物汪或科研汪的“必懷利器”倦蚪。Western Blot的Protocol那么多，然鵝边苹，沒有一款是適合你自己的陵且。辛辛苦苦做了兩天，還不包括前期的細胞培養(yǎng)个束、蛋白提取等等慕购，顯影結(jié)果一現(xiàn)，立馬想哭暈在廁所播急，我的小心臟啊......

我也經(jīng)歷了不分晝夜的虐心歷程，為了得到一條滿意的條帶售睹，潛心做Western Blot一月余桩警，有時在暗室（浸泡在老鼠味兒和飼料味兒中）一連曝光兩個小時，出來后連午飯都不想吃了昌妹，終于捶枢，終于，終于飞崖，喜極而泣袄檬濉！

先上幾幅我做的Western Blot結(jié)果：

引用一位師兄的話：“跑的Western跟磚一樣”」掏幔現(xiàn)將個人做Western的心得體會分享給大家蒜鸡。

實驗虐我千百遍胯努，我待實驗如初戀

言歸正傳，做好Western需要注意各種細節(jié)逢防。工欲善其事叶沛，必先利其器嫉称，首先還是從蛋白提取開始談起答姥。

壹：蛋白提取

一减细、細胞蛋白的提取

1.收樣前3min先配制細胞裂解液（現(xiàn)配現(xiàn)用）盈滴，RIPA:蛋白酶抑制劑:磷酸酶抑制劑=99:1:1渣触。6孔板收集蛋白每孔需200ul川无，計算用量拒炎。以收集六孔蛋白為例孤钦，按比例加入RIPA 1200ul悦昵，蛋白酶抑制劑12ul肴茄，磷酸酶抑制劑12ul，混勻后置于冰上旱捧。（我使用的試劑RIPA裂解液（中）独郎，蛋白酶抑制劑混合物（100×），蛋白磷酸酶抑制劑混合物（100×）均購自康為世紀公司）

2.棄掉舊的培養(yǎng)基枚赡，PBS洗三遍氓癌。

3.每孔加入200ul剛配好的裂解液，立即置于冰上贫橙，在搖床上裂解30min贪婉。

4. 30min后在冰上將6孔板中的細胞收集至EP管中（盡可能多地刮掉細胞）。

5. 14000g卢肃，15min（4℃）離心疲迂，取上清于EP管中即為提取的蛋白（最好用進口Axygen EP管，后文解釋原因）莫湘。

注：2~4步也可先用胰酶收集細胞尤蒿，離心，PBS洗三次幅垮，再向EP管中加入裂解液腰池，置于冰上搖床裂解30min。我也嘗試過這種方法忙芒，相比而言示弓，上一種方法簡便并節(jié)約時間，但可能會損失一些細胞呵萨，可根據(jù)實際情況選擇奏属。

二、組織蛋白的提取

（全程在冰上操作）

1.將動物組織（腦潮峦、肺等）取出后分裝成三份或更多（一份WB囱皿，一份qPCR勇婴，一份備用），取出后立即存于-80℃铆帽。（注：取完一塊組織后立即凍存于-80℃咆耿，反復凍存樣品對待測蛋白有影響，最好用新鮮樣品實驗）

2.配制細胞裂解液（現(xiàn)配現(xiàn)用）爹橱，組織:RIPA=1mg:10ul萨螺，可根據(jù)實際情況調(diào)整。RIPA:蛋白酶抑制劑:磷酸酶抑制劑=99:1:1愧驱。配好后置于冰上慰技。

3.將其中一份組織剪下約90mg于有鋼珠的震蕩勻漿器中勻漿。此勻漿器的蓋子或芯通常置于-20℃组砚，使用時取出吻商，操作應快捷，勻漿1min基本可保持溫度糟红。

4.將勻漿加入90ul現(xiàn)配的裂解液中艾帐，冰上搖床裂解30min。

5. 14000g盆偿，15min（4℃）離心柒爸，取上清于Axygen EP管中即為提取的蛋白。

貳：蛋白濃度測定

我采用的是康為世紀公司的BCA蛋白定量試劑盒測定提取蛋白濃度事扭，和說明書protocol差別不大捎稚，稍有不同，如下：

1.稀釋BSA標準品以制作標準曲線：取7支EP管求橄，每管加30ul生理鹽水今野，第一管加30ulBSA，混勻后再取30ul至第二管罐农，依次倍比稀釋条霜，最后一管不加為空白（即本底值）。則8個標準品的濃度分別為2ug/ul涵亏、1ug/ul宰睡、0.5ug/ul、0.25ug/ul溯乒、0.125ug/ul夹厌、0.0625ug/ul豹爹、0.03125ug/ul裆悄、0。

2. 5倍稀釋樣品蛋白：取六支EP管（6個樣品）臂聋，各管加40ul NS光稼，再分別取10ul樣品在各管中稀釋或南。

3.將8個標準品和稀釋待測樣品各加25ul于96孔板中。

4.配制BCA工作液：每個樣品做2個重復艾君，再加上8個標準品采够，一共20個孔，按22個孔算冰垄，以防加樣損失蹬癌。則需A液：200ul×22=4400ul，B液：4400ul/50=88ul虹茶，計算好所需體積后在一干凈試管中將A逝薪、B工作液混勻。

6.混勻后立即向各孔中加入200ul配制的BCA工作液蝴罪，37℃孵育30min董济。

7.酶標儀562nm下測定各樣品和BSA標準品的吸光度值，作出標準曲線要门，計算出待測樣品的濃度虏肾。

8.根據(jù)各樣品濃度計算1×loading buffer體積，將各樣品濃度調(diào)為一致欢搜；并計算5×loading buffer的體積封豪，加入各管中】癯玻混勻后沸水煮15min撑毛，冰上分裝，存于-20℃唧领。

Tips

1.前面提到收集蛋白于進口Axygen EP管中藻雌，是為了防止煮沸蛋白時EP管蓋子彈開，液體濺出而改變蛋白濃度斩个。

2.關(guān)于分裝體積胯杭，我提取的細胞蛋白調(diào)整濃度后約為1.5ug/ul，每次電泳上樣20ul受啥，所以分裝體積每管50ul做个，一次或兩次電泳即可用完，避免反復凍融滚局。

叁：Western Blot

一居暖、WB所需試劑

可提前配制：

1. 10×電泳緩沖液：

配制250ml 10×電泳液作為母液，依次稱取Tris 7.5g藤肢，甘氨酸36g太闺，SDS 2.5g，加雙蒸水至250ml嘁圈，常溫保存省骂。使用時用蒸餾水稀釋至1×蟀淮。

2. 1×電轉(zhuǎn)液：

配制500ml 1×電泳液，依次稱取Tris 2.9g钞澳，甘氨酸1.45g怠惶，SDS 0.185g，加雙蒸水400ml轧粟，待都溶解后再加入100ml甲醇策治，常溫保存。

配制的電泳液和電轉(zhuǎn)液可供多次Western使用兰吟。

注意：1.最后加入甲醇览妖，若先加甲醇，Tris揽祥、甘氨酸和SDS不易溶解讽膏。

2.溶解較慢時可用磁力攪拌器加快溶解。

現(xiàn)配現(xiàn)用：

分離膠拄丰、濃縮膠府树、5% BSA溶液(w/v)、5%牛奶(w/v)料按、1×TBST洗液奄侠、一抗和二抗，在WB步驟中詳細介紹载矿。

二垄潮、WB protocol

（一）清洗玻板和小燒杯：

戴好口罩和手套，選用1.0mm玻板闷盔，用試管刷和洗潔精仔細刷洗玻板弯洗，清水沖洗干凈》旯矗卡槽對齊卡好后置于軟橡膠墊片上牡整，夾緊，向板中加滿蒸餾水試板子是否漏液溺拱。觀察幾分鐘后若不漏液逃贝，將板子中水倒出，倒扣晾干迫摔。

（二）配膠：

1.配制8ml 10%分離膠沐扳，依次向小燒杯中加入蒸餾水3.04ml，30%丙烯酰胺2.7ml句占，1.5M?pH8.8 2.0ml沪摄，10%SDS 80ul，10%AP 80ul，TEMED 3.2ul卓起。加入TEMED混勻后立即灌膠，用1ml槍頭沿著玻板上沿從左至右輕輕將膠打入凹炸，以免膠濃度不均勻戏阅，避免氣泡產(chǎn)生。加完后換200ml槍頭從左至右更加小心加入蒸餾水水封啤它，以免沖散剛灌的分離膠奕筐。靜置，當水和膠之間出現(xiàn)一條水平的折線時变骡，即已凝固离赫。

2.待分離膠凝固后，將水封的蒸餾水倒出塌碌，可將濾紙條放于玻板角吸水加快殘留水流出渊胸，倒置。配制4ml 5%分離膠台妆，依次向小燒杯中加入蒸餾水2.7ml翎猛，30%丙烯酰胺670ml，0.5M?pH8.8 500ul接剩，10%SDS 40ul切厘，10%AP 40ul，TEMED 4ul懊缺。加入TEMED混勻后立即灌膠疫稿，同上用1ml槍頭從左至右輕輕加入濃縮膠，加滿后沖洗10孔梳子鹃两，水平輕輕插入濃縮膠中靜置待其凝固遗座。可將剩余的濃縮膠沿著梳子加入玻板中以完全密封俊扳。

3.此時员萍，可將之前分裝好的煮過的加入loading buffer的蛋白樣品、預染的蛋白maker 和一小支loading buffer 置于4℃融化拣度。

Little Trick

1.AP和TEMED均為神經(jīng)毒性碎绎、致癌物質(zhì)，使用時需小心抗果。

2.灌膠時視線與膠面水平筋帖，注意操作，避免膠濺入眼睛中冤馏。

在一個月黑風高的夜晚日麸，北京時間22:00，我獨自一人在空蕩蕩的實驗室中配膠，剛好使用了一個槍頭口有問題的1ml藍槍頭代箭。說時遲那時快墩划，濃縮膠從槍頭口的小洞倏地噴到了我的眼睛中。我立即脫掉手套嗡综，洗干凈手乙帮，用大量清水沖洗眼睛，禱告眼睛別出什么問題极景。從此以后察净，每次灌膠我都戴上眼鏡。

3.常溫下半小時膠可凝固盼樟，若天氣寒冷或需加快凝固氢卡，可將其置于37℃孵箱中，15min左右即可凝固晨缴。

4.若第二天早上立即跑膠译秦，這樣就不耽誤午飯時間，可頭天晚上先把膠配好击碗，凝固后取下玻板诀浪，連夾子、梳子一同放入蒸餾水中延都，4℃過夜保存雷猪。

（三）電泳：

1.將玻板卡緊電泳槽中，先在內(nèi)槽加滿已配好的1×電轉(zhuǎn)液晰房，十幾分鐘后觀察是否漏液求摇，若漏液重新調(diào)整玻板，再次卡緊殊者，直至不漏液為止与境。否則，可能膠還沒跑完猖吴，電轉(zhuǎn)液就漏完了摔刁。

2.輕輕拔去梳子，第一孔加入5ul預染的蛋白maker 海蔽，2~7孔依次加入20ul待測蛋白樣品共屈，第8孔加入10ul提前融化的loading buffer。上樣時輕輕加入党窜，注意不要將樣品加入其他孔拗引，或加樣過快導致樣品溢出。

3.插好正負極幌衣，注意檢查正負極不能插反矾削。調(diào)節(jié)電壓至80V（濃縮膠），跑0.5h后；將電壓調(diào)至100V（分離膠）哼凯，約1.5h后欲间，maker分離明顯，在膠底部出現(xiàn)一條藍色的buffer條帶断部，此時電泳完畢猎贴。使用完在實驗儀器使用本上做好登記。

注意：避免藍色條帶跑出分離膠家坎，這樣有可能目的蛋白也已經(jīng)跑出，所以在分離膠底部出現(xiàn)一條整齊水平的藍色條帶時吝梅，即停止電泳虱疏。

Little Trick

1.電泳時插好正負極后，從電泳槽底會有小氣泡上升苏携，氣泡的數(shù)目和上升速率與電壓大小呈正比做瞪。若小氣泡和往常不太一樣，觀察幾分鐘后還是如此右冻，則需檢查是否加錯了電泳液装蓬，或者電泳液配制有誤。

2.一般濃縮膠80V 0.5h纱扭，分離膠100~120V 1~1.5h牍帚，具體跑膠電壓和時間與目的蛋白大小、實驗儀器和實驗室環(huán)境都有關(guān)乳蛾，需多次探索最佳條件暗赶。若目的蛋白較小，則盡量縮短跑膠時間肃叶，并及時觀察maker位置蹂随，避免目的蛋白跑出。我分別實驗了濃縮膠80V 0.5h因惭，80V 1h岳锁，分離膠120V 1.5h，120V 1h蹦魔，100V 1.5h激率，100V 1h，110V 1.5h勿决，110V 1h柱搜，結(jié)果顯示在本實驗室實驗儀器下，我的目的蛋白及內(nèi)參在濃縮膠80V 0.5h剥险，分離膠100V 1.5h條件下聪蘸，分離效果最好。在此條件下，我做了幾次重復實驗健爬，結(jié)果均一致控乾。因此，總結(jié)出本實驗室此目的蛋白的最佳電泳條件娜遵。

3.電泳的好壞直接影響到目的蛋白的顯影情況蜕衡，尤其時磷酸化目的蛋白的二聚體，若電泳條件優(yōu)化设拟，結(jié)果可清晰顯出蛋白表達情況慨仿。所以探索最佳電泳條件是決定勝負關(guān)鍵一步。

4.電泳快結(jié)束時即可準備轉(zhuǎn)膜所需的濾紙和PVDF膜纳胧，浸泡在電轉(zhuǎn)液中镰吆。建議在第一次WB后分別剪好不同大小的硬紙片，標好面積和孔數(shù)（即樣品數(shù)）跑慕，存好以后隨時使用万皿。

5.WB中夾取PVDF膜最好使用平頭鑷子，并夾住膜左上角核行，可最大程度減小對膜上蛋白的損害牢硅。

（四）切膠：

電泳結(jié)束后，取出玻璃板芝雪，稍微沖洗减余，洗凈電泳槽，放好惩系。輕輕撬開玻璃板佳励，根據(jù)maker位置和目的蛋白分子量大小在玻璃板上切膠，為了防止切歪蛆挫，可在玻璃板下墊上上述剪好的同切膠大小一致的硬紙片赃承。一般一塊膠需切下目的蛋白和內(nèi)參兩小塊膠，將切下的膠分別浸泡在電轉(zhuǎn)液中悴侵。

（五）轉(zhuǎn)膜：

1.根據(jù)每一塊切膠的大小剪6張同樣大小的濾紙和一張PVDF膜瞧剖，浸泡于電轉(zhuǎn)液中，可以提前準備好的硬紙片為模板剪可免。PVDF膜先經(jīng)甲醇活化20s后浸泡于電轉(zhuǎn)液中抓于。

2.在電轉(zhuǎn)儀上制作“三明治”結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移膜，最下面放三層濾紙浇借，然后依次放PVDF膜捉撮，膠，三層濾紙妇垢，用玻璃棒輕輕趕走氣泡（注意上下三層濾紙之間不能接觸巾遭，否則易造成短路）肉康。蓋上蓋子，根據(jù)膜的總面積調(diào)整電流灼舍，電轉(zhuǎn)2h吼和。

3.在電轉(zhuǎn)的同時，可以配制以下液體骑素，事先根據(jù)膜的數(shù)量計算好所需體積：

以一塊膜為例炫乓，封閉5ml+稀釋一抗4ml+稀釋二抗4ml，需要13ml献丑，則配制15ml末捣。

5% BSA溶液(w/v)：配制15ml 5% BSA溶液(w/v)，稱取0.75g BSA晶體创橄，溶于15mlTBST中箩做，漩渦振蕩器混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配筐摘，4℃保存（若目的蛋白為磷酸化蛋白時配制）卒茬。

5%牛奶(w/v)：配制15ml 5%牛奶(w/v)船老，稱取0.75g脫脂奶粉咖熟，溶于15ml TBST中，漩渦振蕩器混勻柳畔，現(xiàn)用現(xiàn)配馍管，4℃保存。

1×TBST洗液：使用時將100×TBST用雙蒸水稀釋至1×薪韩，常溫保存确沸。

Little Trick

1.關(guān)于電轉(zhuǎn)膜，有些使用NC膜俘陷。我沒有嘗試過NC膜罗捎，但隔壁實驗室使用NC膜多次WB結(jié)果仍不理想，換用PVDF膜后有所改善拉盾。因此建議還是使用PVDF膜桨菜，可購買Millipore的PVDF膜，一卷有些貴捉偏，但是可以夠一個實驗室用好幾年哪倒得。最好不要在經(jīng)銷商購買分裝的的PVDF膜，另一實驗室一同學想著價格便宜也就只做幾次夭禽，就從試劑公司只買了100cm2的膜霞掺，結(jié)果這價格虛高不說，而且膜還是假的讹躯，直到做完實驗了才發(fā)現(xiàn)菩彬，蛋白樣品也浪費了缠劝。所以建議還是購買Millipore公司原裝的PVDF膜。

2.關(guān)于電轉(zhuǎn)方式挤巡，有些采用濕轉(zhuǎn)剩彬，有些采用半干轉(zhuǎn)，兩種方式均可矿卑。個人覺得半干轉(zhuǎn)方便簡捷些喉恋。

（六）封閉：

1.電轉(zhuǎn)結(jié)束后，根據(jù)maker位置和目的蛋白及內(nèi)參大小剪膜母廷∏岷冢可在標有maker的一邊左上角剪一個小角，以清楚哪一條帶是1號樣品琴昆。

2.分別用已配好的5% BSA和5%牛奶封閉目的蛋白和內(nèi)參氓鄙，室溫搖床上孵育2h。根據(jù)盒子大小业舍，加入封閉液的量需沒過膜抖拦。

（七）孵育一抗：

1.配制p-STAT1一抗（SAB公司），1:500稀釋舷暮，加入上述配制的5% BSA 4ml态罪，再加入8ul p-STAT1一抗，混勻下面，現(xiàn)配現(xiàn)用复颈。

配制actin一抗（康為世紀公司），1:2000稀釋沥割，加入上述配制的5%牛奶4ml耗啦，再加入2ul actin一抗，混勻机杜，現(xiàn)配現(xiàn)用帜讲。

2.將PVDF膜從封閉液中取出，可用平頭鑷子小心放入塑料手套的手指中椒拗，加入一抗似将，封口，使膜完全浸泡在一抗中陡叠，放入冰箱玩郊，4℃過夜。我一般用封口膜做成小盒枉阵，置于大玻璃平皿中译红，放入PVDF膜，用槍從上到下向膜上加一抗兴溜，完全浸沒侦厚，之后和PCR上樣儀一同固定在搖床上耻陕，4℃孵育過夜。

（八）次日刨沦，回收一抗诗宣，做好標記，-20℃保存想诅，可再使用3~4次召庞。將膜放入1×TBST中，搖床上清洗三次来破，每次10min篮灼。

（九）孵育二抗：

1.配制具有種屬特異性的HRP標記的二抗（抗鼠或抗兔），1:2000稀釋徘禁，加入上述配制的5%牛奶4ml诅诱，再加入2ul 二抗，混勻送朱，現(xiàn)配現(xiàn)用娘荡。

2.TBST洗完膜后，加入二抗驶沼，室溫搖床上孵育2h炮沐。

（十）顯影：

1.二抗孵育完后，回收商乎，-20℃保存央拖。1×TBST搖床上洗膜三次祭阀，每次10min鹉戚。

2.一條目的蛋白即一張膜需要100ul發(fā)光液A和100ul發(fā)光液B，根據(jù)膜數(shù)計算用量专控，提前4℃混合好發(fā)光液A和B抹凳。

3.到暗室中加混合好的發(fā)光液，在膠片左上角剪一小角（和PVDF膜一致）伦腐，曝光膠片赢底，可分別不同時長曝光，如15s柏蘑，30s幸冻，1min，5min等咳焚，然后在顯影液和定影液中顯影洽损，放入自來水中。出暗室后革半，將膠片掛起晾干碑定。

也可用Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)照相流码，選擇不同的曝光時間成像。

Little Trick1.需通過不同曝光時間探索某蛋白最佳曝光時間延刘，多次重復實驗即可采用此曝光時長漫试。我最開始也是在暗室中顯影，后來用Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)照相碘赖，對比結(jié)果發(fā)現(xiàn)后者的結(jié)果更加清晰明顯驾荣，背景也更加干凈，之后就一直用成像儀曝光照相了普泡。

2.夾取膠片可用普通鑷子秘车，但也只夾膠片左上角，避免損害膠片上曝光的蛋白條帶劫哼。

3.膠片左上角maker一側(cè)一定要剪一小角或做其它標記叮趴，才可在顯影后明顯對應各個樣品。

4.若暗室曝光权烧，可能內(nèi)參蛋白發(fā)光液剛加上就出現(xiàn)很亮的條帶眯亦，這時最長曝光15s已經(jīng)足夠。

（十）膜重生：

若顯影效果不好般码，可將膜重生妻率，再次顯影，省去了配膠板祝、電泳和電轉(zhuǎn)等步驟宫静。

1.加4ml蛋白印跡膜再生液，室溫搖床30min券时。

2. 1×TBST洗3次孤里，每次10min。

3.5% BSA或5%牛奶封閉2h橘洞。

4.一抗4℃孵育過夜捌袜。

5.次日1×TBST洗三次，每次10min炸枣。

6.二抗孵育2h虏等。

7.1×TBST洗三次，每次10min适肠，曝光成像霍衫。

（本實驗室使用的100×TBST、二抗和白印跡膜再生液均購自康為世紀公司）

但是我實驗幾次膜重生后的結(jié)果并不理想侯养，所以還是乖乖從頭開始做WB敦跌。

Western Blot只是眾多科研技術(shù)方法中的滄海一粟，只要肯探索沸毁，肯總結(jié)峰髓，終會守得云開見月明傻寂。

真理本身就是不斷探索、不斷重復的過程携兵。

科研也就是一件幸福有意思的事疾掰，不是嗎？

最后

祝愿大家

都能跑出漂亮的條帶

都能擁有自己的“個性化Protocol”

都能年年發(fā)paper

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