影響因子：5.8

研究概述：

骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis, OA)是一種退行性炎癥性關(guān)節(jié)疾病陡鹃，是致殘的主要原因烘浦，以長(zhǎng)時(shí)間活動(dòng)后的關(guān)節(jié)疼痛和僵硬為特征；Anoikis為失巢凋亡萍鲸，是一種發(fā)生于細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)丟失或細(xì)胞與ECM之間存在破壞時(shí)的程序性凋亡闷叉。

骨關(guān)節(jié)炎（OA）與失巢凋亡（Anoikis）密切相關(guān)，本研究旨在通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)和單細(xì)胞分析等手段猿推，重點(diǎn)探索失巢凋亡相關(guān)基因在OA的發(fā)生片习、發(fā)展和治療中的表達(dá)水平，并探索新的基于轉(zhuǎn)錄組的失巢凋亡相關(guān)生物標(biāo)志物和 OA進(jìn)展的通路蹬叭。

關(guān)于非腫瘤生信，我們也解讀過(guò)很多状知，主要有以下類型
1 單個(gè)疾病WGCNA+PPI分析篩選hub基因
2 單個(gè)疾病結(jié)合免疫浸潤(rùn)秽五，熱點(diǎn)基因集，機(jī)器學(xué)習(xí)算法等
3 兩種相關(guān)疾病聯(lián)合分析饥悴，包括非腫瘤結(jié)合非腫瘤坦喘，非腫瘤結(jié)合腫瘤或者非腫瘤結(jié)合泛癌分析
4 基于分型的非腫瘤生信分析
5 單細(xì)胞結(jié)合普通轉(zhuǎn)錄組生信分析

目前非腫瘤生信發(fā)文的門檻較低盲再，歡迎交流

流程介紹：

作者首先在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載數(shù)據(jù)集GSE114007和GSE89408，從 GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中收集了與 Anoikis 相關(guān)的一系列基因瓣铣。接著鑒定出37個(gè)Anoikis 相關(guān)差異表達(dá)基因 （DEARGs）答朋。采用Lasso回歸分析鑒定出 10 個(gè) DEARGs，并以此區(qū)分了兩個(gè)失巢凋亡亞型棠笑，進(jìn)行免疫浸潤(rùn)分析梦碗。

隨后作者對(duì)A、B兩個(gè)失巢凋亡亞型進(jìn)行差異分析蓖救，發(fā)現(xiàn)了 1844 個(gè)DEARGs洪规，并采用共識(shí)聚類的方法將OA患者分為基因亞組A和基因亞組B，進(jìn)而進(jìn)行免疫浸潤(rùn)和生物學(xué)功能分析循捺。

在疾病WGCNA分析中發(fā)現(xiàn)MEgreen模塊斩例，在基因亞組WGCNA中發(fā)現(xiàn)MEturquoise模塊最為顯著。利用XGB从橘、SVM念赶、RF和GLM模型鑒定了5個(gè)樞紐基因（CDH2、SHCBP1恰力、SCG2叉谜、C10orf10、PFKFB3）牺勾，使用這5個(gè)基因構(gòu)建的診斷模型在訓(xùn)練和驗(yàn)證隊(duì)列中表現(xiàn)良好正罢。最后使用數(shù)據(jù)集GSE152805在單細(xì)胞水平上分析OA。

研究結(jié)果：

一驻民、失巢凋亡相關(guān)基因的表達(dá)圖譜

1. 在正常組和OA組之間的火山圖中顯示了756 DEGs（圖2A)翻具。作者在756個(gè)DEGs和513個(gè)失巢凋亡相關(guān)基因之間的維恩圖中，鑒定出37個(gè)失巢凋亡相關(guān)差異表達(dá)基因（DEARGs）(圖2B)回还。

2. 圖2C的熱圖可視化了37個(gè)DEARGs裆泳，許多基因在OA樣本中高表達(dá)，包括IGF1柠硕、TUBB3工禾、THY1、MMPP11蝗柔、EGF闻葵、CDH2、EDA2R癣丧、SPP1槽畔、EZH2、CENPF胁编、BUB1厢钧、S100A4鳞尔、TNC、HTRA1早直、MMP3寥假、CXCR4、PLAU霞扬、ITGA4糕韧、TIMP1、CDCP1和PIK3CG等21個(gè)基因祥得。

3. 同時(shí)對(duì)37個(gè)DEARGs的染色體位置進(jìn)行可視化(圖2D)兔沃。為研究這些DEARGs之間的相互作用，作者進(jìn)行了相關(guān)分析级及，發(fā)現(xiàn)CENPF與BUB1之間高度正相關(guān)(圖2E)乒疏。

二、鑒定失巢凋亡亞型

1. 采用Lasso回歸分析饮焦，從37個(gè)DEARGs中獲得10個(gè)基因作為潛在的OA生物標(biāo)志物（圖3A怕吴，B)。

2. 作者基于10 個(gè)DEARGs的表達(dá)县踢，使用共識(shí)聚類算法進(jìn)行無(wú)監(jiān)督聚類以識(shí)別失巢凋亡相關(guān)亞型转绷。將k的值設(shè)置為1–9，結(jié)果表明硼啤，k=2是根據(jù)10 個(gè) DEARGs將42份Oa樣本分為A和B亞型的最佳參數(shù)（圖3C-F)议经。

3. 主成分分析（PCA）結(jié)果顯示A亞型和B亞型之間有明確的區(qū)別（圖3G)。

三谴返、兩種失巢凋亡亞型的免疫浸潤(rùn)具有不同的特征

1. 圖4A的火山圖顯示了兩種失巢凋亡相關(guān)亞型之間的DEGs煞肾。圖4B是28 種免疫細(xì)胞表達(dá)熱圖，顯示兩亞型之間存在差異嗓袱，如漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞和中央記憶 CD4 T 細(xì)胞在 B 亞型中表達(dá)較高籍救。

2. 條形圖顯示了28個(gè)免疫細(xì)胞的不同比例，巨噬細(xì)胞M0和漿細(xì)胞占比很大（圖4C)渠抹◎迹基因集變異分析（GSVA）顯示，糖胺聚糖生物合成硫酸乙酰肝素和糖胺聚糖生物合成硫酸軟骨素在A亞型中高表達(dá)梧却，B亞型主要富集戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化（圖4D)奇颠。

3. GO分析顯示，1844個(gè)與失巢凋亡相關(guān)亞型的DEGs在BP的骨化放航、CC的含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)大刊、MF的核苷三磷酸酶調(diào)節(jié)劑活性和GTP酶調(diào)節(jié)活性中富集（圖5A）。GO分析的圓圖（圖5B)及KEGG條形圖和氣泡圖（圖5C三椿，D 包括前20個(gè)KEGG項(xiàng)）顯示：PI3K-Akt信號(hào)通路和鈣信號(hào)通路主要在KEGG分析中富集缺菌。

4. 作者探索了兩個(gè)亞型的25個(gè)免疫檢查點(diǎn)，共有9個(gè)免疫檢查點(diǎn)基因具有顯著性（圖5E)搜锰。為確定兩種亞型之間的潛在過(guò)程和通路伴郁，作者使用GSEA進(jìn)行了KEGG通路富集分析：包括組氨酸代謝、丙酸代謝蛋叼、核糖體焊傅、RNA降解和泛素在內(nèi)的多種免疫相關(guān)通路主要富集于A亞型（圖5F)。而軸突引導(dǎo)狈涮、基底細(xì)胞癌狐胎、ECM受體相互作用、局灶黏附和Notch信號(hào)通路等通路主要富集于B亞型（圖5G)歌馍。

5. B亞型中的活化B細(xì)胞握巢、活化CD4 T細(xì)胞、活化CD8 T細(xì)胞松却、CD56dim自然殺傷細(xì)胞暴浦、自然殺傷T細(xì)胞、漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞和17型輔助性T細(xì)胞水平顯著高于A亞型（圖6A)晓锻。相關(guān)性分析顯示28個(gè)免疫細(xì)胞與OA存在相關(guān)性：巨噬細(xì)胞與髓源性抑制細(xì)胞的正相關(guān)性最高歌焦，未成熟樹突狀細(xì)胞與活化B細(xì)胞的負(fù)相關(guān)性最高（圖6B)。

6. 圖6C計(jì)算了A砚哆、B兩亞型所有骨關(guān)節(jié)炎患者的 10 個(gè)基因特征和 28 種免疫細(xì)胞類型之間的相關(guān)性：2型輔助性T細(xì)胞和活化CD4 T細(xì)胞與THY1基因呈負(fù)相關(guān)独撇，單核細(xì)胞與TIMP1基因呈正相關(guān)。

7.躁锁，A亞型中CCR纷铣、檢查點(diǎn)和T細(xì)胞共刺激水平較高，B亞型中aDCs灿里、中性粒細(xì)胞关炼、Th1_cells和Th2_cells水平較高（圖6D)。aDCs與MMP11的相關(guān)性最高且呈負(fù)相關(guān)匣吊，APC共刺激與TIMP1基因呈正相關(guān)（圖6F)儒拂。

四、基于失巢凋亡亞型DEGs的基因亞組鑒定

1. 為驗(yàn)證失巢凋亡亞型色鸳，作者對(duì)A社痛、B亞型進(jìn)行差異分析，共發(fā)現(xiàn)了 1844 個(gè)DEARGs命雀∷獍В基于此，作者采用共識(shí)聚類的方法將OA患者分為基因亞組A和基因亞組B（圖7A)吏砂。圖7B顯示每個(gè)聚類之間關(guān)系的項(xiàng)目共識(shí)圖撵儿。從圖7CD可見乘客，共識(shí)評(píng)分在理想分組為 K = 2存在最大值。

2. 圖7E是基于基因亞組的 28 個(gè)免疫浸潤(rùn)熱圖淀歇，表明激活 CD8 T 細(xì)胞和激活 CD4 T 細(xì)胞在基因亞組A中水平較高易核。

五、兩個(gè)基因亞組的免疫浸潤(rùn)和生物學(xué)功能具有不同的特征

1. 根據(jù)基因亞組浪默，圖8A的條形圖將 28 個(gè)免疫細(xì)胞的不同比例可視化牡直。幼稚B細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞和漿細(xì)胞在條形圖中占有很大比例纳决。作者在兩個(gè)基因亞組之間進(jìn)行GSVA碰逸，發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路和堿基切除修復(fù)在A亞組中上調(diào)，而戊糖和葡萄糖醛酸互轉(zhuǎn)化和其他聚糖降解在B亞組中下調(diào)（圖8B)阔加。

2. 圖8C的沖積圖顯示饵史，失巢凋亡亞型和基因亞組之間的分布和關(guān)系相似：活化B 細(xì)胞和 2 型輔助性T細(xì)胞在基因亞組 B中的水平較低，而活化的CD4 T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞在基因亞組 B 中的水平較高（圖8D)掸哑。

免疫相關(guān)通路的比較：T細(xì)胞共抑制和T細(xì)胞共刺激在基因亞組A中更高约急，而Th2細(xì)胞和Treg在基因亞組B中更高（圖8E)。

3. 相關(guān)圖顯示10個(gè)基因與免疫細(xì)胞和通路之間存在顯著相關(guān)性：VEGFA基因與未成熟B細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)苗分，MMP11基因與CD56dim自然殺傷細(xì)胞呈正相關(guān)（圖8F)厌蔽。VEGFA基因與巨噬細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，THY1基因與CCR呈正相關(guān)（圖8G)摔癣。

六奴饮、37種失巢凋亡相關(guān)差異表達(dá)基因（DEARGs）在不同組中的表達(dá)

1. OA樣本中的大多數(shù)基因高于正常樣本。然而DAPK2择浊、FASN戴卜、ITGB4、ITPRIP琢岩、JUP投剥、LTB4R2、MAOA担孔、PAK3江锨、PDK4、PTK6糕篇、RAC3啄育、RHOB、SESN2拌消、SIK1和VEGFA在OA樣品中的表達(dá)較低（圖9A)挑豌。

2. 根據(jù)失巢凋亡亞型繪制37個(gè)DEARGs的箱線圖，可見VEGFA、PLAU氓英、FASN侯勉、TNC、TUBB3债蓝、TUBB3和MMP11在失巢凋亡B亞型中的表達(dá)水平較低壳鹤，而EGF、MAOA 和 PDK4 在失巢凋亡B亞型中的表達(dá)更高（圖9B)饰迹。

2. 比較兩基因亞組間37個(gè)DEARGs的表達(dá)，HTRA1余舶、BUB1啊鸭、HK2、S100A4匿值、MMP3和PDK4等在基因亞組A中的表達(dá)水平較低赠制，而VEGFA、FASN挟憔、JUP钟些、TIMP1、SIK1绊谭、ITGB4政恍、THY1、PTK6和MMP11在基因亞組A的表達(dá)水平較高（圖9C)达传。

因此得出結(jié)論：DEARGs在OA樣本中的表達(dá)較高篙耗，而且有更多的基因在失巢凋亡B亞型和基因亞組B的表達(dá)水平較高。

七宪赶、樞紐基因的鑒定和列線圖的構(gòu)建

1. 基因亞組的WGCNA分析將MEturquoise模塊鑒定為樞紐模塊宗弯，包含1192個(gè)基因（圖10A)。在疾病WCNA分析中搂妻，MEgreen模塊為最顯著模塊蒙保，包含239個(gè)基因（圖10B)。維恩圖顯示了基因亞組 WGCNA 和疾病 WGCNA 分析之間的 114 個(gè)交叉基因（圖10C)欲主。

3. 綜上作者確定XGB模型為最佳模型渐逃，將XGB模型的前5個(gè)基因確定為樞紐基因（CDH2够掠、SHCBP1、SCG2茄菊、C10orf10和PFKFB3）疯潭。作者構(gòu)建了基于樞紐基因的列線圖模型，以探索疾病風(fēng)險(xiǎn)（圖11A)面殖。

4. 利用校準(zhǔn)曲線對(duì)列線圖模型進(jìn)行評(píng)價(jià)竖哩，可見5個(gè)樞紐相關(guān)基因與理想模型吻合較好（圖11B)。DCA曲線顯示脊僚，基于列線圖的決策可能有益于OA患者相叁，且列線圖模型比單個(gè)ARG具有更高的臨床效用（圖11C)。

5. 最后作者使用五個(gè)樞紐基因辽幌，從合并的數(shù)據(jù)集中構(gòu)建單獨(dú)的ROC曲線和完整的ROC曲線 （圖11D增淹，E)。5個(gè)樞紐基因的箱線圖顯示乌企，C10orf10和PFKFB3在OA樣本中的表達(dá)低于正常樣本虑润，CDH2、SCG2和SHCBP1在OA樣本中的表達(dá)高于正常樣本（圖 11F)逛犹。熱圖顯示5個(gè)樞紐基因的表達(dá)情況（圖11G）端辱。

6. 使用GSE55235數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證樞紐基因的表達(dá)。GSE55235中樞紐基因的箱線圖和熱圖與合并數(shù)據(jù)集中的箱線圖和熱圖相同（圖11H虽画，I)舞蔽。

八、ceRNA的構(gòu)建與免疫浸潤(rùn)相關(guān)性分析

1. 作者構(gòu)建了lncRNA-mRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)码撰，有大量lncRNA和miRNA受到五個(gè)樞紐基因的調(diào)控（圖12)渗柿。IncRNAs和SNHG14的has-miR-30b-3p、has-miR-149-3p和has-miR-515-5p脖岛，以及l(fā)ncRNAs的MUC2與樞紐失巢凋亡相關(guān)基因密切相關(guān)朵栖。該網(wǎng)絡(luò)有助于探索骨關(guān)節(jié)炎的潛在機(jī)制，并為后續(xù)的治療策略提供方向柴梆。

2. 作者還對(duì) 5 個(gè)樞紐基因和 28 個(gè)免疫浸潤(rùn)細(xì)胞進(jìn)行了相關(guān)性分析（圖13A)陨溅。結(jié)果表明：

C10orf10與活化B細(xì)胞的關(guān)系最強(qiáng)，與活化的樹突狀細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)绍在；

CDH2與未成熟樹突狀細(xì)胞呈正相關(guān)门扇，與活化B細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)雹有；

PFKFB3與活化B細(xì)胞的相關(guān)性最高，與活化的樹突狀細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)臼寄；

SCG2 在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中呈最高陽(yáng)性霸奕，在活化B細(xì)胞中呈最高陰性；

SHCBP1與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的正相關(guān)關(guān)系最強(qiáng)吉拳，與活性B細(xì)胞的正相關(guān)關(guān)系相反质帅。

綜上所述，這些樞紐基因很可能參與OA發(fā)病過(guò)程中的免疫調(diào)節(jié)留攒。

九煤惩、單細(xì)胞分析：失巢凋亡與OA軟骨中的免疫相互作用

1. 從GSE152805數(shù)據(jù)集中獲得6個(gè)OA樣本的25852個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)譜(圖14A)。nCount_RNA與nFeature_RNA呈正相關(guān)（圖14B)稼跳。方差圖顯示所有細(xì)胞中有 30,738 個(gè)基因盟庞，紅點(diǎn)代表前 2000個(gè)高度變異的基因（圖14C)。

2. 采用24個(gè)鑒定的標(biāo)記基因在不同亞群中顯示并鑒定出相應(yīng)的細(xì)胞類型（圖14D)汤善。作者共發(fā)現(xiàn)14個(gè)獨(dú)立的亞群，并建立了7 種細(xì)胞類型（HomC票彪、RepC红淡、HTC、preFC降铸、FC在旱、preHTC 和 RegC）（圖14E，F(xiàn))推掸。特征圖和小提琴圖顯示了5個(gè)ARG樞紐基因在各種細(xì)胞類型中的分布：C10orf10和BFKFB3的表達(dá)高于其他免疫細(xì)胞類型（圖14G桶蝎，H)。

3 圖15通過(guò)CellChat推斷細(xì)胞間通信谅畅，揭示了全局信號(hào)變化登渣。

（A-B）每種軟骨細(xì)胞亞型之間細(xì)胞相互作用數(shù)量和相互作用強(qiáng)度的圓圖。

（C）OA軟骨中每個(gè)簇的細(xì)胞類型之間的串?dāng)_分析毡泻。

（D）與每個(gè)簇的細(xì)胞類型相關(guān)的基因的表達(dá)胜茧。

（E）OA軟骨簇中7種細(xì)胞亞型的相對(duì)強(qiáng)度 （F）不同簇在SPP1信號(hào)通路中的作用重要性。（G）與SPP1信號(hào)通路相關(guān)的基因的表達(dá)水平仇味。

（H）圓圖顯示了 SPP1 信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞通訊的明顯變化呻顽。OPA軟骨中的SPP1信號(hào)水平增強(qiáng)，pre-FC為信號(hào)通信中心丹墨。

本文采用機(jī)器學(xué)習(xí)和單細(xì)胞分析方法篩選出5個(gè)與失巢凋亡相關(guān)的樞紐基因（CDH2廊遍、SHCBP1、SCG2贩挣、C10orf10和PFKFB3）和免疫相關(guān)細(xì)胞喉前。利用ceRNA對(duì)樞紐基因的開發(fā)可為探索OA的機(jī)制提供相應(yīng)的lncRNA和miRNA没酣，關(guān)鍵基因?yàn)镺A的免疫治療提供潛在的靶點(diǎn)。本研究可能為研究Anoikis相關(guān)基因與OA的關(guān)系提供新的見解被饿。