影響因子：8.786
研究概述：
阿爾茨海默裁馈（AD）是一種嚴重的進行性神經(jīng)退行性疾病，其特征是淀粉樣蛋白-β（Abeta）斑塊過度積累谐岁，神經(jīng)功能障礙和認知障礙醋奠。本文采用ssGSEA、LASSO回歸和WGCNA算法詳細地評估AD患者的免疫微環(huán)境模式伊佃，使用SHAP和LIME算法分析機器學習模型的結(jié)果窜司。接著使用了四個單獨的GEO數(shù)據(jù)庫進行外部驗證，并根據(jù)區(qū)分基因的表達確定了免疫微環(huán)境的不同亞型航揉。隨后使用無監(jiān)督聚類估計免疫微環(huán)境的亞組塞祈，對這些亞型之間的免疫微環(huán)境、增強功能和途徑以及治療藥物的變化進行了進一步的研究帅涂。最后织咧，使用AlzData和泛癌數(shù)據(jù)庫以及RT-PCR分析驗證了特征基因的表達。
流程圖：
研究結(jié)果：
一漠秋、免疫細胞浸潤
作者比較了組合數(shù)據(jù)集中每組28個免疫細胞亞群的富集評分差異：AD患者中B細胞浸潤率較高笙蒙，包括活化B細胞，未成熟B細胞和記憶B細胞庆锦。同時捅位，AD患者表現(xiàn)出較高的T細胞評分，包括中樞記憶CD4+T細胞、效應(yīng)記憶CD8+T細胞艇搀、自然殺傷T細胞尿扯、調(diào)節(jié)性T細胞、1型T輔助細胞和17型T輔助細胞焰雕。自然殺傷細胞衷笋，巨噬細胞，肥大細胞矩屁，MDSC辟宗，中性粒細胞和樹突狀細胞在AD患者中也有更高的細胞評分（圖2A，B）吝秕。
作者評估了GSE122063中28個免疫細胞評分的差異泊脐。結(jié)果顯示，除活化B細胞烁峭、活化CD8+T細胞容客、CD56bright自然殺傷細胞、中樞記憶CD8+T細胞约郁、γδT細胞缩挑、2型T輔助細胞外，其余22個免疫細胞富集評分在對照組和AD組之間表現(xiàn)出顯著差異（圖2C鬓梅，D）调煎。
結(jié)合以上結(jié)果副硅，作者最終在AD患者中鑒定了13種差異表達的免疫細胞蜘腌，包括中樞記憶CD4 T細胞弧岳，效應(yīng)記憶CD8 T細胞薄嫡，未成熟B細胞迹蛤，巨噬細胞氨鹏，肥大細胞争拐，MDSC粮坞，記憶B細胞艘绍，自然殺傷細胞赤拒，自然殺傷T細胞，中性粒細胞诱鞠，漿細胞樣樹突狀細胞挎挖，調(diào)節(jié)性T細胞，1型T輔助細胞和17型T輔助細胞航夺，表明浸潤免疫細胞的改變與AD病理密切相關(guān)蕉朵。
作者使用LASSO回歸算法，從上述13個免疫細胞亞群中最終確定了6個系數(shù)非零的最優(yōu)的與AD進展相關(guān)的特征性免疫細胞(漿細胞樣樹突狀細胞阳掐、17型T輔助細胞始衅、未成熟B細胞冷蚂、自然殺傷細胞、MDSC和中性粒細胞)(圖2E-G)汛闸。
二蝙茶、免疫微環(huán)境相關(guān) DEGs 的鑒定
- 根據(jù)組合數(shù)據(jù)集的表達譜進行WGCNA，確定AD患者中與上述六種特征性免疫細胞亞型相關(guān)的核心模塊诸老。根據(jù)PickSoftThreshold函數(shù)將軟閾值b設(shè)置為4時隆夯，無標度拓撲網(wǎng)絡(luò)和連通性最有效(圖3A)。通過分層聚類算法將聚類樹分為11個不同顏色的基因模塊(圖3B)别伏。
2.綠黃色模塊（986個基因）與未成熟B細胞（R=0.67）蹄衷，MDSC（R=0.72）、自然殺傷細胞（R=0.75）畸肆、中性粒細胞（R=0.34）和17型T輔助細胞(R= 0.64)的正相關(guān)性最高宦芦。而藍色模塊(2426個基因)與未成熟B細胞(R= -0.7)宙址、MDSC (R= -0.62)轴脐、自然殺傷細胞(R= -0.68)、中性粒細胞(R= -0.59)抡砂、17型T輔助細胞(R= -0.73)呈最高負相關(guān)(圖3C)大咱。
- 因此作者選擇綠黃和藍色模塊內(nèi)的基因進行進一步分析。經(jīng)過交叉最終從ImmPort和innateDB數(shù)據(jù)集中鑒定出26個由綠黃模塊相關(guān)基因注益、AD碴巾、免疫相關(guān)基因共享的免疫微環(huán)境相關(guān)的DEGs（圖3D）。此外丑搔，我們還在藍色模塊中確定了5個與免疫微環(huán)境相關(guān)的DEG（圖3E）厦瓢。
- 與這31個免疫微環(huán)境相關(guān)DEG的表達水平相比，對照組和AD組之間產(chǎn)生了獨特的免疫微環(huán)境特征啤月。AD患者的HSP90AB1和PPP3R1表達水平明顯低于非AD對照組煮仇，其余29個DEG在AD患者中的表達水平明顯高于非AD對照組（圖3F，G）谎仲，表明這些免疫微環(huán)境相關(guān)的DEGs可能與AD進展密切相關(guān)浙垫。
三、免疫微環(huán)境相關(guān)DEG的相關(guān)性和功能富集分析
- 作者根據(jù)基因表達數(shù)據(jù)描繪了31種與免疫微環(huán)境相關(guān)的DEGs相互作用的綜合景觀郑诺，并確定了4種不同的模式夹姥。這些DEGs大多數(shù)表現(xiàn)出較強的協(xié)同效應(yīng)(圖4A)。
2. 31種與免疫微環(huán)境相關(guān)的DEGs與28種免疫細胞亞群之間的相關(guān)性模式結(jié)果(圖4B)一致強調(diào)了這些免疫微環(huán)境相關(guān)的DEGs與免疫細胞顯著相關(guān)辙诞，表明免疫微環(huán)境的改變可能是促進AD進展的重要病理生理機制辙售。
- 功能富集分析顯示，這些免疫微環(huán)境相關(guān)DEGs主要富集在生物學功能上(圖4C)飞涂。KEGG富集分析表明圾亏，免疫介導(dǎo)的信號通路十拣、多種人類疾病、經(jīng)典信號通路等與這些免疫微環(huán)境相關(guān)的DEGs密切相關(guān)志鹃。(圖4D)
四夭问、機器學習模型的開發(fā)和估計
1.為了確定預(yù)測AD的最佳機器學習模型，作者將組合數(shù)據(jù)集中436個樣本(247個正常樣本和189個AD樣本)隨機分為訓練隊列(70%曹铃，N=305)和測試隊列(30%缰趋，N=131)。選取31個免疫微環(huán)境相關(guān)DEG的表達譜作為輸入變量陕见，建立XGBoost秘血、CatBoost、SVM评甜、LightGBM灰粮、LR和RF等6個機器學習模型來預(yù)測結(jié)果。
2.訓練隊列中忍坷，多個機器學習模型(準確率粘舟、AUC、召回率佩研、精度柑肴、F1、kappa和MCC)在訓練隊列中的表現(xiàn)如下圖S2A所示旬薯。LightGBM模型的準確率(0.797)晰骑、AUC(0.858)、召回率(0.736)绊序、精密度(0.792)硕舆、F1(0.759)、kappa(0.585)和MCC(0.591)最高骤公。SVM模型精密度(0.731)最低抚官，AUC(0.808)最低。
- 測試隊列中淋样，XGBoost 模型性能最佳耗式，其AUC值為0.86 (CatBoost: 0.84, SVM: 0.80, LightGBM: 0.85, LR: 0.76, RF: 0.80)， P-R值為0.83 (CatBoost: 0.83, SVM: 0.77, LightGBM: 0.82, LR: 0.68, RF: 0.76)(上圖S2A-E和下圖5A-C)趁猴。
4.計算準確性刊咳、召回率、精密度儡司、F1娱挨、kappa 和 MCC后，圖5C結(jié)果顯示XGBoost模型優(yōu)于其他模型捕犬，LightGBM模型性能次之跷坝。因此酵镜，后續(xù)預(yù)測選擇XGBoost和LightGBM模型。
五柴钻、機器學習模型的全局和局部解釋
1.通過SHAP值闡明每個特征變量對預(yù)測模型的影響淮韭。基于 XGBoost 模型的 SHAP 匯總圖對特征變量的重要性排序表明贴届，對 XGBoost 模型貢獻最大的前 5 個變量是 CXCR4靠粪、PPP3R1、HSP90AB1毫蚓、CXCL10 和 S100A12（圖6A）占键。
- 采用 SHAP 依賴分析來描述單個特征變量如何影響 XGBoost 預(yù)測模型的結(jié)果（圖 6B）。特征變量的 SHAP 值越高元潘，AD 的可能性就越大畔乙。
3.LightGBM模型中最重要的5個變量與XGBoost模型中的變量一致（圖6C）。SHAP 依賴分析也用于解釋每個特征變量對 LightGBM 模型輸出的影響（圖6D）翩概。
- 圖6E-I介紹了關(guān)于影響XGBoost模型結(jié)果的前5個免疫微環(huán)境相關(guān)DEG的更詳細信息牲距。總體而言氮帐，PPP3R1和HSP90AB1的低表達水平對AD的發(fā)展有重要影響嗅虏，此外洛姑，高水平的CXCR4上沐，CXCL10和S100A12與AD進展密切相關(guān)。
采用SHAP和LIME算法楞艾，通過從測試集中抽取患者和正常人來解釋AD的個體化預(yù)測参咙。SHAP中，粗體數(shù)字對應(yīng)于概率預(yù)測(f(x))硫眯，基值表示沒有模型輸入的預(yù)測蕴侧。右側(cè)的藍色條表示正常預(yù)測，左側(cè)的粉紅色條表示 AD 概率增加的預(yù)測两入。
圖7A净宵、C分別為基于SHAP力圖和LIME算法的正常情況。
①基于XGBoost模型預(yù)測AD概率為11%裹纳。
②XGBoost模型預(yù)測增強AD發(fā)病的特征變量是：IL1R2表達1.18择葡，CXCL2表達1.01，IL4R表達1.69剃氧，TNFAIP3表達2.26敏储，C5AR1表達1.17。
③降低AD風險的特征變量包括CXCR4朋鞍，PPP3R1已添，CXCL10妥箕，GBP2和S100A12。
④XGBoost 模型是當前樣本預(yù)測結(jié)果的對照更舞，與樣本的實際結(jié)果一致畦幢。
- 圖7B、D分別為基于SHAP力圖和LIME算法的AD案例缆蝉。
①基于 XGBoost 模型的預(yù)測AD 概率為 94%呛讲。
②患者CXCR4(4.86)、NFKBIA(4.89)返奉、PPP3R1(3.00)贝搁、HSP90AB1(4.47)、IL4R(1.79)升高導(dǎo)致AD風險增加芽偏，而S100A12(1.97)雷逆、CXCL10(0.76)、IL1R2(1.92)污尉、FCER1G(0.34)膀哲、IFITM1(4.36)表達可降低AD風險。
③XGBoost模型的預(yù)期輸出是AD被碗，實際結(jié)果也是AD某宪。
- 圖7E描述了測試隊列中所有正常和AD腦組織樣本的全局解釋。
六锐朴、特征基因的選擇和驗證
基于平均SHAP值兴喂，作者交叉了XGBoost和LightGBM預(yù)測模型中的前5個特征變量，最終確定了兩模型共有的5個特征基因（CXCR4焚志，PPP3R1衣迷，HSP90AB1，CXCL10和S100A12）酱酬。
利用ROC曲線分析評估每個特征基因在內(nèi)部數(shù)據(jù)集中預(yù)測AD進展的診斷能力壶谒。
訓練集中ROC曲線的AUC值CXCR4為0.792，PPP3R1為0.713膳沽，HSP90AB1為0.678汗菜，CXCL10為0.647，S100A12為0.667(圖8A)挑社。
測試集中ROC曲線的AUC值CXCR4為0.774陨界，PPP3R1為0.697，HSP90AB1為0.687滔灶，CXCL10為0.645普碎，S100A12為0.648(圖8B)。
聯(lián)合集中ROC曲線的AUC值CXCR4為0.787录平，PPP3R1為0.707麻车，HSP90AB1為0.681缀皱，CXCL10為0.645，S100A12為0.661(圖8C)动猬。
3.另外使用三個外部驗證數(shù)據(jù)集啤斗，進一步驗證這五個特征基因的診斷效果（圖8D-F)。
通過這五個特征基因來構(gòu)建AD發(fā)展預(yù)測工具赁咙，即列線圖钮莲，每個特征變量的值與一個分數(shù)點相關(guān)，將所有特征變量的得分相加得到總得分彼水，代表AD發(fā)病風險(圖8G)崔拥。
校準曲線證實了列線圖診斷AD的準確性（圖8H）。DCA顯示列線圖的臨床應(yīng)用為AD患者帶來了一定的臨床益處（圖8I）凤覆。
七链瓦、AD患者免疫微環(huán)境中的亞型的鑒定
1.為闡明AD中免疫微環(huán)境相關(guān)的表達模式，作者采用共識聚類算法盯桦，根據(jù)5個特征基因?qū)?89個AD腦組織樣本進行分組慈俯。基于結(jié)果拥峦、CDF 圖贴膘、CDF 曲線面積的相對變化和一致的聚類評分，選擇 k = 2 作為最佳值略号，將 189 名患者分為兩種不同的亞型刑峡，其中亞型 1有112 個樣本，亞型2有 77 個樣本（圖 9A–D）璃哟。
2. tSNE分析表明亞型1和2之間存在明顯差異（圖9E）氛琢。亞型之間9個特征基因的表達存在明顯的異質(zhì)性（圖9F）喊递。差異分析表明随闪，在亞型1和2之間發(fā)現(xiàn)了1055個上調(diào)和609個下調(diào)的DEG（圖S3）。
作者使用MSigDB數(shù)據(jù)庫中的基因集來描述豐富的生物功能和信號通路骚勘，并進行GSVA以估計每位患者的評分：在亞型1中铐伴，與免疫應(yīng)答相關(guān)的生物學功能高度富集，包括肥大細胞活化俏讹、免疫應(yīng)答当宴、細胞趨化性、細胞因子介導(dǎo)的信號通路和炎癥反應(yīng)（白細胞細胞遷移泽疆、趨化性和粘附）户矢；亞型2的生物學功能主要參與囊泡的轉(zhuǎn)運、代謝過程殉疼、氧化磷酸化和線粒體內(nèi)膜的組織梯浪。
與此一致捌年，亞型1富集的途徑始終與免疫應(yīng)答相關(guān)，包括B細胞受體信號通路挂洛，細胞因子-細胞因子受體相互作用礼预，腸道IgA的產(chǎn)生，缺口信號通路和TGF-β信號傳導(dǎo)虏劲。而在亞型2中托酸，神經(jīng)退行性疾病和代謝相關(guān)途徑被激活。
八柒巫、免疫微環(huán)境亞型間免疫特征的鑒別
1.首先比較了每個亞型內(nèi)28個免疫細胞亞群的差異励堡。
與亞型2組相比，亞型1組患者的T細胞浸潤率更高堡掏，包括中樞記憶CD4+T細胞念秧、中樞記憶CD8+T細胞、效應(yīng)記憶CD4+T細胞布疼、自然殺傷T細胞摊趾、調(diào)節(jié)性T細胞、1型T輔助細胞和17型T輔助細胞游两。
同時砾层，包括活化B細胞、未成熟B細胞和記憶B細胞在內(nèi)的多個B細胞贱案，以及包括自然殺傷細胞肛炮、巨噬細胞、肥大細胞宝踪、MDSC侨糟、中性粒細胞在內(nèi)的先天免疫細胞在亞型1組的免疫微環(huán)境中也有較高的富集評分（圖10A，B）瘩燥。
- 關(guān)于每個亞型之間免疫特征的差異（圖10C）秕重。
在亞型1中，所有免疫共刺激基因和幾乎所有與抗原呈遞和細胞粘附相關(guān)的免疫基因都始終高表達厉膀。同時溶耘，亞型1也表現(xiàn)出免疫共抑制劑，配體服鹅，受體和其他相關(guān)基因的表達增強凳兵。
- 此外，還比較了每種免疫微環(huán)境亞型的免疫評分企软，亞型1患者的免疫評分高于其他亞型（圖10D）庐扫。結(jié)合上述結(jié)果最終將亞型1確定為免疫亞型，亞型2為代謝亞型。
九形庭、相關(guān)性分析和治療靶點預(yù)測
1.為進一步探索這5個特征基因的功能杰妓，作者利用外部數(shù)據(jù)集GSE106241（其中包括更詳細的臨床信息）來闡明這些特征基因與AD病理生物標志物之間的相關(guān)性。HSP90AB1與α分泌酶活性（R=-0.37）碘勉，β分泌酶活性（R=-0.46）和AD臨床分期（R=-0.28）呈負相關(guān)（圖11A-C）巷挥。而CXCL10與β分泌酶活性呈正相關(guān)（R=-0.46）（圖11D）。
2. PPP3R1也表現(xiàn)出與α-分泌酶（R =-0.32）验靡，β-分泌酶（R=-0.57）倍宾，γ-分泌酶（R=-0.37）和Aβ-42水平（R=-0.28）的活性負相關(guān)（圖11E-H）。
此外胜嗓，圖11I描述了有關(guān)這五個特征基因的其他信息高职，例如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子辞州，miRNA和針對這五個特征基因的多種藥物怔锌。最后使用CMap探索靶向免疫亞型1和代謝亞型2的潛在治療藥物。
小分子化合物的CMap評分越低变过，它就越有可能具有治療疾病的能力埃元。MK-866、花生四烯基三氟甲烷媚狰、TTNPB岛杀、伏立諾他和 STOCKIN-3584 是亞型 1 中 CMap 評分最低的前五種小分子化合物（圖 11J），而 TTNPB崭孤、Butein类嗤、PHA-00816795和 STOCKIN-3584 是代謝亞型 2 相關(guān)的小分子化合物（圖 11K）。亞型1和亞型2共享三種常見的小分子化合物辨宠，包括花生四烯基三氟甲烷遗锣，TTNPB和STOCKIN-3584。CMap評分表明嗤形，MK-866和花生四烯基三氟甲烷分別是靶向免疫亞型1和代謝亞型2的最佳治療藥物精偿。
十、特征基因差異表達的外部驗證
1.利用在線工具AlzData數(shù)據(jù)庫派殷，與正常對照組相比还最，AD患者海馬體和皮質(zhì)組織中CXCR4的表達顯著增加，而HSP90AB1和PPP3R1的表達明顯降低毡惜。
2.在AD患者的顳葉皮層和額葉皮層中也觀察到CXCL10表達的顯著增加。但正常人與AD患者在不同大腦區(qū)域中S100A12的表達差異并不顯著（圖12A-E）斯撮。
3.在20種癌癥類型和相鄰正常組織之間進行泛癌分析经伙，CXCR4、PPP3R1、HSP90AB1帕膜、CXCL10和S100A12的表達水平在多種類型的癌組織中顯著升高（圖12F）枣氧。
4.在與33種癌癥類型的患者生存顯著相關(guān)的特征基因中，所有特征基因都與至少三種癌癥類型的患者的總生存期密切相關(guān)（圖12G）垮刹。
- 最后進行RT-PCR分析驗證這5個特征性免疫微環(huán)境相關(guān)基因的表達譜达吞。與腦組織樣本數(shù)據(jù)集的結(jié)果類似，CXCR4荒典、CXCL100和S100A12在AD皮質(zhì)神經(jīng)元中的表達水平明顯更高酪劫，而HSP1AB3和PPP1R12基因表達顯著下調(diào)（圖12H）。
研究總結(jié)：
本研究解釋了免疫微環(huán)境狀態(tài)與AD發(fā)病機制之間的緊密關(guān)系寺董。作者從六種中選擇兩種較優(yōu)的機器學習方法覆糟，LightGBM和XGBoost，使用SHAP和LIME算法解釋機器學習模型遮咖，鑒定出5個免疫微環(huán)境相關(guān)的特征基因（CXCR4滩字，PPP3R1，HSP90AB1御吞，CXCL10和S100A12）麦箍，這些基因與AD病理生物標志物密切相關(guān)，能夠可靠地預(yù)測AD的進程陶珠。
此外内列，基于這些特征差異基因，本文為AD提出了一個全新的分子分類背率，包括免疫和代謝亞型话瞧。每種亞型都顯示出不同的富集功能和途徑、免疫細胞浸潤寝姿、免疫學特征和治療藥物交排。這些結(jié)果為腦組織中免疫微環(huán)境與AD患者預(yù)后和分類之間的關(guān)系提供了新的視角。
