1.參考文獻
Brookes, E. et al. Polycomb associates genome-wide with a specific RNA polymerase II variant, and regulates metabolic genes in ESCs. Cell Stem Cell 10, 157–170 (2012).
2.文章中的原始數(shù)據(jù)：
ACCESSION NUMBERS（文章中）
ChIP-seq and mRNA-seq data have been submitted to the GEO repository
under accession number GSE34520.GEO網(wǎng)站：GSE34520 顯示：
| GSE34518 | Polycomb associates genome-wide with a specific RNA polymerase II variant, and regulates metabolic genes in ES cells (ChIP-Seq) | Organism : Mus musculus | Samples (9) | Overall design：Examination of 4 different RNAPII modifications (S5p, S7p, 8WG16, S2p), and the histone modifications H2Aub1 and H3K36me3 in mouse ES cellsSRA數(shù)據(jù)ID： https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/study/?acc=SRP009883 點擊Accession List 下載列表并保存到文件，命名為
SRR_Acc_List.txt使用prefetch下載聪全。
3.數(shù)據(jù)分析簡要流程圖
4.安裝必備軟件
（1）下載SRR數(shù)據(jù)的軟件液斜，并安裝：sratoolkit.2.10.8 和 aspera
#方法1：sratoolkit.2.10.8
#下載（速度比較慢）：
>>> wget https://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sdk/2.10.8/sratoolkit.2.10.8-centos_linux64.tar.gz
#解壓：
>>> tar xzvf sratoolkit.2.10.8-centos_linux64.tar.gz
#添加環(huán)境配置：
>>> echo 'export PATH=/root/usr/local/sratoolkit.2.10.8-centos_linux64/bin:$PATH' >> ~/.bashrc（PATH="/sratoolkit的安裝路徑/bin"）
>>> source ~/.bashrc
#方法2：Aspera(以前可以柬姚，現(xiàn)在報錯了，不知原因)
>>> wget http://download.asperasoft.com/download/sw/connect/3.7.4/aspera-connect-3.7.4.147727-linux-64.tar.gz
#解壓縮
>>> tar zxvf aspera-connect-3.7.4.147727-linux-64.tar.gz
# 安裝（不能用root安裝蝇率，要用user安裝）
>>> bash aspera-connect-3.7.4.147727-linux-64.sh
# 環(huán)境配置
>>> echo 'export PATH=~/.aspera/connect/bin:$PATH' >> ~/.bashrc
>>> source ~/.bashrc
（2）下載Miniconda3，并安裝泌枪，創(chuàng)建chipseq鏡像恼布，并安裝需要的軟件
#!/bin/bash
wget https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/miniconda/Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh
#安裝 Miniconda3
bash Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh
#使用conda之前需要對其做環(huán)境配置（/root/miniconda3/：miniconda3 安裝路徑）
export PATH="/root/miniconda3/bin:"$PATH
conda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/pkgs/free
conda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/cloud/conda-forge
conda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/cloud/bioconda
conda config --set show_channel_urls yes
# 創(chuàng)建名字為chipseq的conda
conda create -n chipseq python=2 bwa
conda info --envs
source activate chipseq
# 可以用search先進行檢索
conda search trim_galore
## 保證所有的軟件都是安裝在 wes 這個環(huán)境下面
conda install -y sra-tools
conda install -y trim-galore samtools
conda install -y deeptools homer meme
conda install -y macs2 bowtie bowtie2
5.數(shù)據(jù)分析
（1）數(shù)據(jù)下載（下載NCBI的SRA數(shù)據(jù)失敗螺戳，直接下載EBI的fastq.gz）
使用aspera從EBI下載fastq數(shù)據(jù)，拋棄NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫
ENA主頁：https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/home
- 1.隨便搜索需要的SRR數(shù)據(jù)：SRR391032
- 2.點擊:PRJNA1546325
- 3.查看fastq.gz的數(shù)據(jù)格式（可以看出該文章的數(shù)據(jù)為單端測序）
數(shù)據(jù)下載代碼
#!/bin/bash
#source activate chipseq
# ways1:下載SRA數(shù)據(jù)(下載速度很慢折汞，且下載容易中斷):
cat ./SRR_Acc_List.txt | while read id
do ( nohup prefetch $id & )
done
# ways2:ascp下載raw.fastq.gz(下載SRA數(shù)據(jù)報錯：ascp: Failed to open TCP connection for SSH, exiting.Session Stop (Error: Failed to open TCP connection for SSH))
cat SRR_Acc_List.txt | while read i
do
x=$(echo $i | cut -b1-6)
echo era-fasp@fasp.sra.ebi.ac.uk:/vol1/fastq/$x/$i/$i.sra
ascp -QT -l 300m -P33001 -i ~/.aspera/connect/etc/asperaweb_id_dsa.openssh era-fasp@fasp.sra.ebi.ac.uk:/vol1/fastq/$x/$i/$i.fastq.gz /outdir/
（2）trim_galore:自動檢測adapter的質(zhì)控軟件
第一步首先去除低質(zhì)量堿基倔幼，然后去除3' 末端的adapter, 如果沒有指定具體的adapter，程序會自動檢測前1million的序列字支，然后對比前12-13bp的序列是否符合以下類型的adapter:
- Illumina: AGATCGGAAGAGC
- Small RNA: TGGAATTCTCGG
- Nextera: CTGTCTCTTATA
trim_galore過濾及質(zhì)控代碼：
# 安裝
source activate chipseq
conda install trim_galore
# 過濾
analysis_dir=./Data/
ls $analysis_dir/Raw_Fastq/*gz | while read fq1;
do
nohup trim_galore -q 25 --phred33 --length 25 -e 0.1 --stringency 4 -o $analysis_dir/Clean_Fastq/ $fq1 &
done
# 質(zhì)控Fastqc
ls ./Raw_Fastq/*gz | xargs fastqc -t 10 -o ./Fastq_QC/
ls ./Clean_Fastq/*gz | xargs fastqc -t 10 -o ./Fastq_QC/
（3）下載參考基因組的索引和注釋文件（小鼠常用mm10）
# 索引大小為3.2GB凤藏， 不建議自己下載基因組構(gòu)建，可以直接下載索引文件堕伪，代碼如下：
>>> wget -4 -q ftp://ftp.ccb.jhu.edu/pub/data/bowtie2_indexes/mm10.zip
>>> unzip mm10.zip
