影響因子：7.3

研究概述：

晝夜節(jié)律紊亂（CRD）是阿爾茨海默捕帜取（AD）發(fā)病機制的關(guān)鍵因素，本研究旨在闡明CRD如何在AD免疫微環(huán)境中發(fā)揮作用淘钟。作者利用晝夜節(jié)律評分（CRscore）量化來自AD的單細胞RNA測序數(shù)據(jù)集中晝夜節(jié)律紊亂的微環(huán)境狀態(tài)宦赠，每種免疫細胞類型亞群中不同水平的CRscore與不同的免疫特征，細胞間通訊米母，代謝途徑和轉(zhuǎn)錄特征密切相關(guān)勾扭。最后應(yīng)用基于機器學(xué)習的整合模型，構(gòu)建CRD特征铁瞒，并采用RT-PCR分析驗證其表達水平妙色。

研究流程圖：

關(guān)于非腫瘤生信，我們也解讀過很多慧耍，主要有以下類型
1 單個疾病WGCNA+PPI分析篩選hub基因
2 單個疾病結(jié)合免疫浸潤身辨，熱點基因集，機器學(xué)習算法等
3 兩種相關(guān)疾病聯(lián)合分析芍碧，包括非腫瘤結(jié)合非腫瘤煌珊，非腫瘤結(jié)合腫瘤或者非腫瘤結(jié)合泛癌分析
4 基于分型的非腫瘤生信分析
5 單細胞結(jié)合普通轉(zhuǎn)錄組生信分析

目前非腫瘤生信發(fā)文的門檻較低，有需要的朋友歡迎交流
研究結(jié)果：

一泌豆、AD免疫微環(huán)境中基于CRD的單細胞轉(zhuǎn)錄圖譜

1. 作者最初使用Seurat方法重新分析了先前發(fā)表的scRNA-seq數(shù)據(jù)集(GSE181279定庵，包括2個正常和3個AD外周血樣本)。經(jīng)過質(zhì)量控制過濾踪危，從5個樣本的36725個細胞中共獲得18400個獨特基因(圖2A)蔬浙。

2. 在對基因表達進行歸一化后，作者使用基于UMAP的聚類贞远，并根據(jù)高度可變的基因確定了總共12個不同的細胞簇畴博。根據(jù)多種細胞標記劃分為可識別的細胞類型:CD4+ T細胞、CD8+ T細胞蓝仲、NK細胞绎晃、B細胞、骨髓細胞和巨核細胞 (圖2B杂曲、C)庶艾。

3. 圖2D顯示了每個樣品中不同細胞類型的比例，AD患者中CD4+ T細胞擎勘、CD8+ T細胞咱揍、B細胞和巨核細胞豐富。圖2E顯示了每種細胞亞型中前20個特征基因的表達圖譜棚饵，表明這些獨特的標記物可以精確地區(qū)分細胞亞型煤裙。

4.將2091個CRG與1098個AD相關(guān)DEGs交叉掩完，最終確定了201個差異表達的CRGs。在STRING數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上進行交互分析硼砰，預(yù)測它們之間的關(guān)系且蓬，并基于功能注釋分析確定相應(yīng)的子網(wǎng)或鄰域。通路富集分析顯示题翰，這些差異表達的CRGs主要影響細胞因子受體相互作用恶阴、cAMP信號通路、FoxO信號通路豹障、晝夜節(jié)律冯事、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)抗原加工和遞呈以及蛋白質(zhì)加工(圖2F)。

5. 隨后關(guān)注AD樣本來源細胞與CRD之間的關(guān)系血公。采用評分算法量化AD細胞中的CRscore昵仅。如圖2G和S1C所示，各細胞簇的CRscore明顯更高累魔。與其他細胞亞型相比摔笤，B細胞的CRscore更高，即更強的晝夜節(jié)律CR垦写。圖S1D根據(jù)CRscore將AD細胞分為高低兩組籍茧，9個周期蛋白相關(guān)基因(CCNC、CCND2梯澜、CCND3寞冯、CCNH、CCNI晚伙、CCNK吮龄、CCNL1、CCNL2和CCNT1)在低CR的AD細胞中顯著上調(diào)(圖S1E)咆疗，表明低CR組細胞周期激活顯著漓帚。

圖S1：單細胞水平上的CRD特征

二、AD中基于CRscore的B細胞亞群的單細胞RNA測序

1. 作者從AD樣本中提取2811個B細胞進行亞聚類分析午磁，鑒定出7個不同的細胞簇(圖3A)尝抖，進一步細分為4個B細胞亞組：幼稚B細胞，記憶B細胞迅皇，干擾素刺激基因(ISG+) B細胞和生發(fā)中心(GC) B細胞(圖3B)昧辽。B細胞亞群的平均數(shù)量和細胞比例在高低CR組之間有相當大的差異(圖3C)。

2. 圖3D顯示了每種細胞類型中前30個特征基因和標記基因的表達景觀登颓，表明這四個B細胞亞群的表達明顯不同搅荞。除了蛋白質(zhì)輸出和MMPs外，高CR組的抗原呈遞和表面標記物的表達明顯高于低CR組，而低CR組的促炎和趨化因子受體的表達明顯高于高CR組(圖3E)咕痛。

3. 基于CellPhoneDB的細胞-細胞結(jié)合分析顯示痢甘，高CR組的GC B細胞經(jīng)常通過CD40LG_CD40和CD70_CD27等配體受體對，與其他3種B細胞相互作用茉贡。同時塞栅，高CR組的記憶B細胞通過HLA-F_LILRB1、CD70_CD27腔丧、APP_SORL1與GC B細胞相互作用(圖3F)放椰。

4. 圖3G進行了SCENIC 分析，以確定轉(zhuǎn)錄因子（TFs）從低CR到高CR的變化悔据。高CR組表現(xiàn)出多數(shù)為活化的TFs庄敛，并抑制少數(shù)TFs：BHLHE41和E2F6俗壹，表明CRD與AD患者的TF失調(diào)密切相關(guān)科汗。

5. 進行GSVA以評估不同CR水平AD患者之間生物學(xué)功能的差異，檢測到代謝過程绷雏、線粒體電子傳遞头滔、核糖體組裝、泛素蛋白連接酶活性和細胞分裂的負調(diào)控是高CR組的富集特征(圖3H)涎显。利用代謝途徑富集分析進一步比較表明坤检，高CR組中與抗壞血酸和醛酸鹽、鞘糖脂生物合成期吓、其他聚糖降解早歇、色氨酸、β-丙氨酸讨勤、甘油磷脂箭跳、磷酸戊糖和谷氨酸相關(guān)的代謝過程顯著上調(diào)(下圖S2A)。

6. 偽時序分析描述了不同B細胞分化的時間序列潭千。幼稚B細胞主要定位于分化途徑的起點谱姓，而GC B細胞普遍存在于分化途徑的末端(上圖3I)。這些發(fā)現(xiàn)表明刨晴，幼稚的B細胞可以轉(zhuǎn)化為GC B細胞屉来。下圖S2B觀察到此過程中：表面標志物，趨化因子受體和蛋白質(zhì)輸出相關(guān)基因發(fā)生了顯著改變狈癞。

三茄靠、AD中基于CRscore的CD4+ T細胞表現(xiàn)出不同的分子特征

1. 根據(jù)UMAP分析確定AD中CD4+ T細胞簇的6個亞組(圖4A)。根據(jù)已知的標記物（ANXA1蝶桶、ANXA2嘹黔、CCR7、LEF1、TCF7儡蔓、SELL郭蕉、CCL5、GZMK和GZMA）將CD4+ T細胞分為3個亞組喂江，包括CD4_C01_ANXA1召锈、CD4_C02_CCR7和CD4_C03_CCL5 (圖4B)。高低CR組之間每個亞組的相應(yīng)豐度存在差異（圖4C）获询。

2. 圖4D描繪了亞組標記基因和每個亞組的前30個差異表達基因涨岁。

CD4_C01_ANXA1被分配到中樞記憶CD4+ T細胞，其特征是ANXA1和ANXA2的表達;

CD4_C02_CCR7高表達的初始標記物(CCR7吉嚣、SELL梢薪、TCF7和LEF1)代表初始CD4+T細胞。

CD4_C03_CCL5細胞毒效應(yīng)因子(GZMK尝哆、GZMA秉撇、CCL5)表達增加，表明它們與細胞毒效應(yīng)因子CD4+ T細胞密切相關(guān)秋泄。

3. 使用CellPhoneDB比較組間CD4+ T細胞亞群的細胞間相互作用琐馆。從CD4_C01_ANXA1和CD4_C02_CCR7細胞到CD4_C03_CCL5細胞的低CR組中，APP_CD74恒序、COPA_CD74瘦麸、MIF_CD74和SIRPG_CD47等多個配體受體對具有活性(圖4E)。

4. 圖4F的PROGENy分析顯示歧胁，低CR組在14個經(jīng)典疾病進展相關(guān)通路中的11個中表現(xiàn)出顯著上調(diào)滋饲，表明CD4+ T細胞中低水平的CRscore似乎與AD進展更密切相關(guān)。

5. 圖4G顯示低CR組中喊巍，與抗原呈遞(HLA-A屠缭、HLA-B、HLA-DPA1玄糟、HLA-DQA1勿她、HLA-DQB1、HLA-DQB2阵翎、MICA和MICB)逢并、表面標記物(MS4A1、CD22郭卫、CD52砍聊、CD74、CD83贰军、CD63玻蝌、TNFRSF17蟹肘、TNFRSF18和SEC61B)、趨化因子受體(IL4R俯树、CXCR4帘腹、CXCR5、CCR6和CCR10)和蛋白質(zhì)輸出(SEC61B许饿、SPCS2阳欲、SPCS3和SEC11C)相關(guān)的大多數(shù)基因的表達均有所增加。

6. 圖S3A 的GSVA顯示陋率，低CR組主要參與晝夜節(jié)律減弱球化，細胞穩(wěn)態(tài)，巨噬細胞遷移瓦糟，RNA遷移和toll樣受體2信號通路筒愚。隨后作者進一步全面評估了具有不同CRscore水平的CD4 T細胞之間代謝途徑的差異，在85個代謝途徑中菩浙，有44個在低CR組和高CR組之間有顯著差異巢掺。具有低CRscore的CD4 T細胞富含更多的代謝途徑和基因（圖4H，I）芍耘。

7. 作者進行SCENIC 分析以估計CD4+ T細胞分化過程中CRD的上游TFs：低CR組的相關(guān)TF為CR1D1址遇、RELB熄阻、PRDM1斋竞、CREM、RORC秃殉、KLF10坝初、NR3C1、BHLHE40钾军、FOSB鳄袍、NFKB2、ATF3吏恭、CEBPD拗小、JUN、DDIT3樱哼、ELF1哀九、IRF1、JUNB搅幅、FLI1阅束、ETV7、YY1茄唐、FOS息裸、STAT1、JUND、KLF6和SPIB呼盆。據(jù)報道年扩，作為cAMP響應(yīng)元件的調(diào)節(jié)劑，JUNB和CREM有抑制CD4調(diào)節(jié)性T細胞的功能（圖4J）访圃。

8. 使用Monocle 3方法交叉證實CD4+ T細胞群是由在分化過程中處于不同階段的細胞分組組成的：分化狀態(tài)起初在CD4_C02_CCR7簇周圍發(fā)生變化常遂，而CD4_C03_CCL5位于發(fā)育階段的末端（圖4K）。在分化起始階段的基礎(chǔ)上挽荠，幾種表面標志物（CR2克胳、CD63、CD40圈匆、CD37漠另、CD27和CD38）和CCR7降低，而其他表面標志物（MS4A1跃赚、CD63和TNFRSF18）笆搓、趨化因子受體（CXCR4、CXCR5和CCR6）和蛋白輸出基因（SEC61B纬傲、SPCS1满败、SPCS2和SPCS3）在分化過程中增加（上圖S3B）。

四叹括、AD中基于CRscore的CD8+ T 細胞顯示出信號傳導(dǎo)算墨、細胞間通訊和分化失調(diào)

1. 為闡明CD8+ T細胞之間的異質(zhì)性，使用UMAP分析將5250個CD8+ T細胞重新聚集成7個簇(圖5A)，在圖5B中進一步分為CD8_C01_CCR7 (幼稚細胞)、CD8_C02_GNLY (TEMRA細胞)没宾、CD8_C03_GZMK(細胞毒性效應(yīng)細胞)和CD8_C04_SLC4A10 (MAIT細胞)。與高CR組的樣本相比挖藏，這四種亞型的數(shù)量在低CR組中下降(圖5C)。

2. 圖5D描述了每個集群的前30個差異表達基因厢漩。高低CR組之間CD8+ T細胞亞群的細胞-細胞相互作用分析表明膜眠，低CR組顯示：從CD8_C01_CCR7細胞到其他亞型，APP_CD74溜嗜、APP_SORL1宵膨、COPA_CD74、HLA-E_KLRC1粱胜、LGALS9_SORL1柄驻、SELL_SELPLG、TNFSF10_RIPK1和TYROBP_CD44配體受體對的活性增加焙压。

3. 低CR組中CCL4L2_PGRMC2鸿脓、CD58_CD2抑钟、TNFSF12_TNFRSF25和TNFSF14_TNFRSF14的富集證明了CD8_C04_SLC4A10在募集其他三個亞群中的潛在作用（圖5E）。

4. PROGENy分析表明野哭，經(jīng)典的致病通路（NFkB在塔、TNFα、雄激素拨黔、EGFR蛔溃、p53、缺氧篱蝇、MAPK和TGFβ）在低CR組顯著富集贺待，而高CR組與PI3K，WNT零截，雌激素麸塞，JAK-STA和VEGF信號通路的激活密切相關(guān)(圖5F)。此外涧衙，除了蛋白質(zhì)輸出基因外哪工，與抗原呈遞、表面標記弧哎、趨化因子受體雁比、促炎和MMPS相關(guān)的大多數(shù)標記基因的表達都在低CR組中得到增強(圖5G)。

5. 對85條代謝途徑的富集分析顯示撤嫩，有27條代謝途徑在高低CR組之間明顯不同偎捎，高CR組有13條代謝途徑被激活，低CR組有14條代謝途徑被抑制(圖5H)非洲。與此一致的是鸭限，低CR組也集中于更多的代謝基因(圖5I)蜕径。

6. 圖5J采用SCENIC分析來檢測各組間TF的差異：45種失調(diào)TFs中有24種在低CR組中富集两踏。圖5K彌散圖偽時間中，CD8_C01_CCR7細胞主要位于最未分化狀態(tài)兜喻，CD8_C02_GNLY和CD8_C03_GZMK細胞位于CD8_C01_CCR7簇的明顯下游軌跡梦染，CD8_C04_SLC4A10位于最后分化階段。

7. 圖S4A進行GSVA以闡明兩組之間的分子特征差異：高CR組表現(xiàn)出免疫應(yīng)答朴皆，免疫細胞分化帕识，線粒體電子轉(zhuǎn)運和神經(jīng)炎癥反應(yīng)的增加，而低CR組主要受神經(jīng)元凋亡過程遂铡、中性粒細胞肮疗、肥大細胞和髓細胞的激活以及脂氧合酶途徑的調(diào)節(jié)。

8. CD8+ T細胞亞群分化過程中扒接，基因表達分布模式存在顯著差異：表面標志物CD27和趨化因子受體（CXCR5和CCR6以及CCR7）在偽時間過程中以未分化狀態(tài)突出表達伪货，而其他表面標志物（CD52们衙，CD40，CD37碱呼，CD38蒙挑，CD63和TNFRSF18）和蛋白質(zhì)輸出標志物（SEC61B，SPCS1愚臀，SPCS2和SPCS3）在CD8 T細胞分化階段減少（圖S4B）忆蚀。

五、使用bulk轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)集驗證CRscore的有效性和穩(wěn)健性

1. 由于涉及scRNA-seq數(shù)據(jù)集的樣本不足姑裂，因此作者收集了幾個與AD相關(guān)的獨立基因表達數(shù)據(jù)集來驗證CRscore的性能馋袜。在GSE106241數(shù)據(jù)集中，根據(jù)CRscore的中位數(shù)將AD樣本分為高低兩組舶斧，圖6A顯示低CR組和高CR組之間1387個上調(diào)和1217個下調(diào)DEGs的表達模式桃焕。在這些情況下，高CR組的樣本的CRscore明顯高于低CR組(圖6B)捧毛。

2. 在低CR組中觀察到更多的晚期AD患者观堂，而年齡和性別的分布沒有統(tǒng)計學(xué)差異（圖6C）。此外呀忧，相對于高CR組师痕，低CR組的CRscore表現(xiàn)出幾種典型AD相關(guān)病理標志物的活性增加，包括包括Aβ42而账，α分泌酶胰坟，β分泌酶和γ分泌酶(圖6D-G)。

3. 在12條經(jīng)典致病通路中泞辐，低CR組主要負責激活TGFβ笔横，JAK-STAT，p53咐吼，VEGF吹缔，TNFα，雄激素锯茄，NFkB和EGFR信號通路(圖6H)厢塘。

4. 在GSE84422和GSE48350的聯(lián)合數(shù)據(jù)集中，高低CR組也表現(xiàn)出明顯不同的基因表達模式和兩組之間的CRscore分布(圖6I, J)肌幽。同樣晚碾，低CR組患者屬于V+VI期的比例也高于高CR組 (圖6K)。此外喂急，在組合數(shù)據(jù)集的低風險組中也可以觀察到與GSE106241數(shù)據(jù)集相似的致病途徑的激活(圖6L)格嘁。這些發(fā)現(xiàn)表明，基于差異表達的晝夜節(jié)律基因特征的CRscore算法可以在bulk轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集中準確定義AD患者的CR活性廊移。

5. 使用CMap數(shù)據(jù)庫研究了低CR和高CR患者的前瞻性治療藥物糕簿，以評估AD患者的個體化臨床治療涣易。X4-5-二苯胺基鄰苯二甲酰亞胺、法舒地爾冶伞、PHA-00816795新症、TTNPB和MK-886是低CR組具有個性化治療潛力的前五種藥物（圖6M）。而RRNPB响禽、NU-1025徒爹、花生四烯基三氟甲烷、exisulind和MS-275是高CR評分AD患者的五種最有效的治療藥物（圖6N）芋类。具體而言隆嗅，MK-866和MS-275分別在低和高CR組中具有最低的CMap評分，在CR評分不同的AD患者中顯示出最大的治療益處侯繁。

六胖喳、CRD涉及AD免疫微環(huán)境的改變

1. 作者在合并數(shù)據(jù)集的AD樣本中使用ssGSEA、MCPcounter贮竟、xCell丽焊、ABIS和ESTIMATE算法評估了CRD水平與免疫細胞浸潤之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)低CR患者的免疫細胞亞群浸潤水平明顯高于高CR患者咕别，證實在ssGSEA技健、MCPcounter、xCell和ABIS算法中惰拱，大多數(shù)免疫細胞在低評分組明顯豐富(圖7A)雌贱。同時，包括CCL5和CCL20在內(nèi)的幾種免疫趨化因子在低CR條件下升高偿短，并被證實在調(diào)節(jié)性T細胞的積累中發(fā)揮關(guān)鍵作用欣孤。

2. 在低CR患者中，MHC-I昔逗、MHC-II降传、免疫抑制劑、免疫刺激劑纤子、趨化因子和趨化因子受體普遍升高搬瑰，而在高CR患者中，HLA-DOB控硼、KIR2DL1、PVR艾少、CXCL14卡乾、CXCL12、CX3CL1和CCL1的表達水平較高(圖7B)缚够。

3. 另一方面幔妨，低CRscore患者的免疫評分水平明顯升高(圖7C)鹦赎。ssGSEA算法顯示，CRscore與大多數(shù)浸潤免疫細胞豐度呈負相關(guān) (圖7D)误堡。

4. 使用另一個數(shù)據(jù)集GSE106241驗證 AD 患者的 CRscore 與免疫學(xué)特征之間的關(guān)聯(lián)古话。同樣，低CR患者也有更高水平的免疫細胞浸潤和免疫反應(yīng)锁施。這些結(jié)果表明陪踩，CRD可以誘導(dǎo)AD患者免疫微環(huán)境的重塑，為單細胞水平的觀察提供額外的支持（圖S5）悉抵。

七肩狂、特征性 CRD 標志的綜合構(gòu)建

1. 為了進一步篩選與AD相關(guān)的特征性CR調(diào)控因子，首先將這些單細胞數(shù)據(jù)集中差異表達的201個CRGs擬合到基于機器學(xué)習的綜合模型中姥饰，以建立共識的CRD特征傻谁。對GSE63060中的110種預(yù)測模型進行了10次交叉驗證，并計算了每種模型在所有驗證數(shù)據(jù)集上的AUC值列粪。RF+Lasso組合被確定為最佳模型审磁，平均AUC值最高(0.753)。此外岂座，該組合模型在所有驗證數(shù)據(jù)集中也顯示出較高的AUC值(圖8A)力图。

2. 基于201個差異表達的CRGs的表達格局，Boruta算法識別出GSE5281中27個重要的CRGs掺逼。隨后根據(jù)這27個CRGs的表達數(shù)據(jù)吃媒，將其擬合到Lasso模型中，通過10倍交叉驗證吕喘，證明最優(yōu)lambda值為0.0222赘那，實現(xiàn)了最小的部分似然偏差(圖8B、C)氯质。最后基于Lasso的機器學(xué)習模型識別出一組9個非零系數(shù)的特征CRD標志(圖8D)募舟。

3. 利用Lasso模型中9個特征CRGs的系數(shù)加權(quán)表達，計算每位患者的風險評分闻察。使用6個外部數(shù)據(jù)集來比較riskScore與其他臨床變量(年齡和性別)在預(yù)測AD進展方面的診斷效果拱礁。在GSE5281、GSE33000辕漂、GSE122063和GSE140829中呢灶，riskScore的準確性明顯優(yōu)于其他臨床特征，包括年齡和性別(圖8E-J)钉嘹。故基于9個CRGs的風險評分可能為AD的初始診斷提供新的見解鸯乃。

八、在泛癌癥隊列和皮質(zhì)神經(jīng)元中的驗證

1. 為了進一步驗證構(gòu)成風險評分的特征CRGs的表現(xiàn)跋涣，接下來探討了這些CRGs在20種癌癥類型和相應(yīng)的鄰近正常組織中的表達水平：MEF2C缨睡、NR4A1和MAST4在大多數(shù)腫瘤中均顯著下調(diào)鸟悴，而幾乎所有腫瘤均顯著表達PSMA5、SEC61G奖年、RGS1细诸、CEBPB和H2AFV(圖9A)。

2. 此外陋守，作者旨在闡明這9個特征性CRGs與33種癌癥預(yù)后的相關(guān)性震贵。研究發(fā)現(xiàn)，所有這些基因都與至少三種癌癥類型的總體生存率有相當大的相關(guān)性嗅义。特別是H2AFV屏歹、CEBPB、SEC61G之碗、GLRX和PSMA5在多種癌癥中的總生存率明顯較差蝙眶，這與它們在多種癌癥組織中的高表達一致(圖9B)。

3. RT-PCR分析顯示褪那，AD組皮層神經(jīng)元中GLRX幽纷、MEF2C、PSMA5博敬、NR4A1和SEC61G基因的表達水平明顯低于對照組友浸，而RGS1和CEBPB基因的表達水平則明顯高于對照組(圖9C)

研究總結(jié)：

這項研究基于晝夜節(jié)律相關(guān)基因（CRG）的轉(zhuǎn)錄組譜，在單細胞水平上展示了AD免疫微環(huán)境中的CRD狀態(tài)偏窝。根據(jù)來自AD樣本的單細胞測序數(shù)據(jù)收恢，研究了CRscore對主要免疫細胞（B細胞，CD4+ T細胞和CD8+ T細胞）的影響祭往，較低的CR評分與AD發(fā)病機制和進展顯著相關(guān)伦意。利用多種綜合機器學(xué)習算法，為診斷AD提出了一種包括9個晝夜節(jié)律相關(guān)基因(CRGs)的CRD特征硼补。

綜上驮肉，作者結(jié)合bulk RNA測序和單細胞分析，闡明了CRD與AD異質(zhì)性的密切關(guān)系已骇，針對晝夜節(jié)律基因的藥理調(diào)節(jié)可能是AD聯(lián)合治療的一種有前途的治療策略离钝。