最近看到李家洋院士團隊2021年在《cell》發(fā)表的這篇文章A route to de novo domesticationof wild allotetraploid rice滋觉，感覺很有意思，另外這篇文章引用不少參考文獻(xiàn)似乎對我的課題很有用，可以看看糕殉。不得不感嘆岛啸，這篇文章涉及到的知識面之廣，工作量之大。https://hub.pubmedplus.com/10.1016/j.cell.2021.01.013
之前一些研究主要是將作物野生祖先的一些優(yōu)良基因?qū)氲浆F(xiàn)代作物中著角，企圖恢復(fù)作物馴化過程中丟失的基因事富。這篇研究改變思路技俐，提出從野生稻開始從頭馴化的育種策略，在基因編輯以及測序手段沒有成熟之前统台，這項工作是不敢想象的雕擂，然而，近年來生物學(xué)技術(shù)的突破突飛猛進贱勃，尤其是CRISPR/Cas9技術(shù)在各個模式生物中的普及井赌，給從頭馴化提供了可能。
以下是文章正文：
栽培水稻品種都是二倍體募寨，水稻多倍體化因其在基因組適應(yīng)力和環(huán)境穩(wěn)健性方面的優(yōu)勢而一直受到人們的關(guān)注族展。然而，可行的研究路線仍然沒有被開發(fā)出來拔鹰。在這里仪缸，我們描述了一種實用的研究策略，即從頭馴化野生異源四倍體水稻列肢。通過篩選異源四倍體野生稻庫恰画，我們確定了一個基因型 Oryza alta (CCDD)、多倍體水稻 1 (PPR1)瓷马，并為其從頭馴化建立了兩個重要資源：(1) 高效的組織培養(yǎng)拴还、轉(zhuǎn)化和基因組編輯系統(tǒng)(2) 高質(zhì)量的基因組組裝，兩個各自含有12 條染色體的亞基因組欧聘。在這項研究中片林，利用這些資源，通過編輯控制二倍體水稻中這些性狀的基因的O. alta 同源物，可以迅速改善六種重要的農(nóng)藝性狀费封。我們的研究結(jié)果表明焕妙，從頭馴化的異源四倍體水稻有可能被開發(fā)成一種新的谷物，以加強世界糧食安全弓摘。
Introduction:
多倍體化由全基因組復(fù)制或種間雜交產(chǎn)生焚鹊，是開花植物的一種常見進化模式，多倍體植物往往在生物量韧献、生長活力和對環(huán)境變化的適應(yīng)性方面具有顯著優(yōu)勢末患。所以這篇文章的作者認(rèn)為多倍體作物作為可以作為未來應(yīng)對全球氣溫升高，災(zāi)害加劇等環(huán)境變化的手段锤窑。
現(xiàn)代栽培稻由祖先野生二倍體水稻Oryza?rufipogon馴化而來璧针，在馴化過程中，各種重要的農(nóng)藝性狀被作為選擇標(biāo)準(zhǔn)渊啰，包括種子落粒陈莽、直立植株構(gòu)型、穗形虽抄、芒長走搁、顆粒大小和品質(zhì)、殼色等迈窟。由于二倍體水稻的基因組簡單和轉(zhuǎn)化系統(tǒng)搞笑私植，作為模式生物在諸多農(nóng)藝性狀的研究已經(jīng)非常深入，許多成果已經(jīng)用于育種车酣。曾經(jīng)有研究者提出栽培稻進行多倍體化曲稼，但問題是他們的遺傳背景有限。
迄今為止湖员，已鑒定出27種水稻屬植物贫悄，并劃分為11個不同的基因組類型株搔，包括6個二倍體(AA耗啦、BB枷邪、CC闲孤、EE、FF和GG)和5個異源四倍體(BBCC摹菠、CCDD眼耀、HHJJ宽气、HHKK和KKLL)肠缨。其中逆趋，來自南美的具有CCDD基因組的物種比栽培的二倍體水稻具有更大的生物量和更強的生物和非生物抗性。帶有CCDD基因組的異源四倍體水稻起源于一次雜交事件晒奕，以CC基因組種為母本闻书，以DD基因組型為父供體的已滅絕種(O. australiensis, EE基因組型是DD現(xiàn)存的近親屬)名斟。由于缺乏參考基因組以及轉(zhuǎn)化和再生困難，對異源四倍體水稻的研究在很大程度上落后于研究良好的具有AA基因組的二倍體水稻品種魄眉。
傳統(tǒng)的將野生植物馴化為良好作物通常需要數(shù)百年甚至數(shù)千年的時間蒸眠，但最近發(fā)展的基因組編輯技術(shù)使這一目標(biāo)在幾代人的時間內(nèi)實現(xiàn)成為可能。因此杆融，迫切需要高效的基因組編輯系統(tǒng)來加快馴化的步伐。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)僅在水稻亞種粳稻和秈稻中得到了有效的發(fā)展霜运；然而脾歇，在O. glaberrima和具有AA基因組的野生稻中，轉(zhuǎn)化效率仍然很低淘捡。對于異源四倍體野生稻來說藕各，它們的轉(zhuǎn)化仍然是個不小的挑戰(zhàn)，盡管其中一些可以以極低的速率再生焦除。
在這里激况，我們通過篩選野生異源四倍體水稻庫，建立有效的轉(zhuǎn)化和基因組編輯系統(tǒng)膘魄，組裝高質(zhì)量的注釋乌逐，描述了從頭馴化和改良野生稻相對異源四倍體O. alta (CCDD) 的途徑。24 條染色體闡明了異源四倍體水稻基因組的遺傳藍(lán)圖和進化史创葡，以及基于二倍體水稻知識的馴化相關(guān)基因和農(nóng)藝學(xué)重要基因的基因組編輯浙踢。我們的工作為創(chuàng)造新作物以滿足未來糧食需求提供了實用策略。
2 Results：
2.1野生異源四倍體水稻的從頭馴化路線圖：為了培育多倍體水稻作物灿渴，我們開發(fā)了一個從頭馴化路線圖洛波，即重新馴化野生異源四倍體水稻(圖1A)。整個馴化過程可分為四個步驟：第一步骚露，選擇合適的起始材料進行新生馴化蹬挤；第二步，建立理想的技術(shù)體系棘幸，包括參考基因組焰扳、基因的功能注釋，以及高效的轉(zhuǎn)化和基因組編輯系統(tǒng)误续；第三步蓝翰，對馴化相關(guān)基因或等位基因進行多重基因組編輯，設(shè)計并快速導(dǎo)入女嘲，然后進行田間評價畜份；第四步，新作物的認(rèn)證和推廣欣尼。然而爆雹，野生異源四倍體水稻既沒有合適的起始材料停蕉，缺乏必要的技術(shù)體系。
2.2異源四倍體O. alta基因型PPR1轉(zhuǎn)化體系的建立:
為了確定最有希望的起始材料钙态，我們認(rèn)為愈傷組織的誘導(dǎo)和再生能力是最重要的屬性慧起，其次是合適的生物量特性和對非生物和生物脅迫的抗性。因此册倒，我們從種質(zhì)資源庫中收集了28個具有CCDD基因組的株系蚓挤，包括8個alta株系、2個grandiglumis株系和18個latifolia株系驻子，并利用二倍體水稻的典型方法測試了它們的愈傷組織誘導(dǎo)和再生能力灿意。
我們發(fā)現(xiàn)一些品系具有適度的愈傷組織誘導(dǎo)能力，但大多數(shù)品系的再生率非常低崇呵，除了一種基因型 O. alta（來自中國南寧野生稻種質(zhì)資源國家苗圃的登錄號 2007-24）缤剧，其在愈傷組織誘導(dǎo)和再生方面表現(xiàn)良好（圖 S1A；表 S1）域慷。在此基礎(chǔ)上荒辕，我們優(yōu)化了方案，最終實現(xiàn)了一個令人滿意的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)犹褒，轉(zhuǎn)化效率為 80%抵窒，再生能力為 40%（圖 S1B-S1E）。因此叠骑，我們認(rèn)為該材料可作為進一步進行重新馴化研究的模型估脆，并將其命名為多倍體水稻1 (PPR1) 重要的是，PPR1 的雜合率也很低（<0.2%）（圖 S2A）座云，這對基因組測序和組裝是一個有利的特征疙赠。雖然它的生物量比栽培水稻大得多，但它具有典型的非馴化特征朦拖，例如高度 > 2.7 m（圖 1B）圃阳、寬而長的葉子（圖 1C）、穗長 > 48 cm璧帝，小穗稀疏（圖 1D）和小粒度（千粒重 8.79 克）捍岳，芒 > 4 厘米（圖 1E）。綜上所述睬隶，我們選擇PPR1作為從頭馴化的起始模型材料锣夹，建立了高效的PPR1的組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化體系，從而克服了從頭馴化過程中最大的障礙之一苏潜。
2.3組裝高質(zhì)量的PPR1基因組和同源亞基因組
第二個挑戰(zhàn)是組裝高質(zhì)量的PPR1 基因組银萍。我們通過生成 121.1 Gb (123.42X) 的單分子實時測序數(shù)據(jù)、287.1 Gb (292.62X) 的 BioNano 數(shù)據(jù)恤左、103.2 Gb (105.18X) 的高通量染色質(zhì)構(gòu)象捕獲來采用集成的基因組測序和組裝方法 (Hi-C) 數(shù)據(jù)和 85.2 Gb (86.79X) Illumina 短讀長（圖 S2B 和 S2C）贴唇，并實現(xiàn)了包含 24 條假設(shè)染色體的高質(zhì)量組裝搀绣，其中片段重疊 N50 為 18.2 Mb，超級腳手架（super scaffold）N50 為 37.1 Mb(PPR1 V1.0）（表 1）戳气，總基因組大小為 894.6 Mb（876.4 Mb 錨定在染色體上）链患。然后，我們通過為 10 個代表性組織生成 235 Gb 的 RNA 測序 (RNA-seq) 數(shù)據(jù)構(gòu)建了一個基因表達(dá)圖譜瓶您，其對 PPR1 V1.0 的平均映射率為 92.81%（圖 S3A 和 S3B）麻捻。在來自轉(zhuǎn)錄組測序的 482,997 個轉(zhuǎn)錄本中，90.16% 在 PPR1 V1.0 中檢測到呀袱，具有超過 99% 的同一性（圖 S3C）贸毕。最后，預(yù)測和功能注釋了 99312 個蛋白質(zhì)編碼基因压鉴，包括 81421 個高置信度和 17891 個低置信度基因，平均長度為 3021 bp（圖 S3D 和 S3E）锻拘。此外油吭，我們注釋了 1253 個假基因和 17104 個非編碼 RNA，包括 12,332 個 microRNA署拟，2032個RNAs, 1147個tRNAs, 207個小核RNA (snRNAs)婉宰， 1057個小核仁RNA(snoRNAs)， 10個信號識別顆粒RNA (srpRNAs)推穷，和319個其他非編碼RNA(ncRNAs)(表S2)心包。在預(yù)測的蛋白編碼基因中，99.94%不均勻地分布在24條染色體上馒铃，末端基因較多(圖1F)蟹腾。我們發(fā)現(xiàn)，BenchmarkingUniversal Single-Copy Orthologs (BUSCO)基因集中98.2%的完整基因被收集区宇，顯示了基因組裝配的高準(zhǔn)確性和完整性娃殖。
2.4異源四倍體O. alta的基因組特征
為了探索 O.
alta 和O. sativa 之間的基因相似性，我們比較了PPR1 HC 基因（81,839 個基因）和Nipponbare MSU 基因組（55986 個基因）议谷，發(fā)現(xiàn)日本晴的 43599 個（77.87%）基因在O. alta 中有同源物炉爆，包括在 Ct 和 Dt 亞基因組上具有同源基因的 39,543 個（70.41%）基因（圖 2A）。同時卧晓，我們發(fā)現(xiàn)在栽培的二倍體水稻中芬首，O. alta 的 Ct 和 Dt 亞基因組上的 10,862 和 9,982 個基因沒有發(fā)現(xiàn)同源物，這可能是因為一些基因在進化中同源高度分化的逼裆。由于O. alta 表現(xiàn)出強烈的生物和非生物抗性表型郁稍，我們進一步鑒定了O. alta 中的抗性基因類似物（表 S5）。雖然 O. sativa ssp 粳稻 Nipponbare 和秈稻 R498 與 Ct 或 Dt 亞基因組（圖 2B）相比胜宇，含有更多的核苷酸結(jié)合位點（NBS）類型基因艺晴，這是由于 NBS-亮氨酸富集重復(fù)（NBS -LRR) 基因組中的O. meridionalis 和O. glumaepatula 分裂后的 AA 基因組昼钻，O. alta 對于所有四種類型的抗性基因類似物總共包含更多基因，顯示出更廣泛的潛力抗性譜封寞。此外然评，Ct 和 Dt 亞基因組和 AA 基因組中轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的數(shù)量相似（圖 S4A S4C；表 S5）狈究。這些結(jié)果表明O.alta 基因組包含大量尚未用于栽培水稻的遺傳資源碗淌。此外，基于O.alta和其他9個物種之間的蛋白同源性抖锥，共鑒定出42,642個基因家族亿眠，其中Ct和Dt亞基因組分別為19,925和18,519個(圖2C)。在這些家族中磅废，有14125個家族在Ct纳像、Dt和O. sativa中相同，525個家族在Ct基因組具有特異性拯勉，363個家族在Dt基因組具有特異性竟趾。基于單拷貝基因家族的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示宫峦，o.alta Ct亞基因組和o.sativa基因組是最近的鄰居岔帽，證實了之前的假設(shè)，即AA基因組與CC基因組比與DD/EE基因組有更近的共同祖先导绷。AA基因組與CC基因組犀勒、CC基因組與DD基因組的估計分化時間分別為457萬年前和545萬年前(MYA)。
異源四倍體 O.alta 的 Ct 和 Dt 亞基因組均明顯大于日本晴和 R498 的亞基因組妥曲。分析表明贾费，O. alta 基因組的 61.7% (551.5 Mb) 由重復(fù)序列組成（表 1），遠(yuǎn)高于日本晴的 40.43% 和 R498 的 42.05%檐盟。主要區(qū)別在于長末端重復(fù)序列 (LTR)铸本，這是占 O. alta 基因組 24.1%(215.93 Mb) 的主要重復(fù)序列，明顯高于日本晴的 17.55% 和 R498 的 20.55%（圖 2D）遵堵。 Gypsy 型 LTR 是最豐富的轉(zhuǎn)座因子亞科箱玷，覆蓋了 O. alta 基因組的 19.9% (177.60 Mb)（圖 2D；表 S2）陌宿。然而锡足，估計Gypsy和 Copiatype LTR 的插入突變時間小于一個 MYA（圖 2E）。重復(fù)序列和Gypsy-type LTRs分別占Dt亞基因組的62.6%和21.6%壳坪，高于Ct亞基因組的59.2%和18.7%(圖2D)舶得。 PIF-Harbinger轉(zhuǎn)座子富集在編碼區(qū)上游和下游2kb內(nèi)(圖S2D)，表明它們可能在順式元件的進化中發(fā)揮作用爽蝴。這些結(jié)果表明沐批，Gypsy LTRs的擴增是O.?alta基因組擴增的主要動力纫骑。
2.5 帶有CCDD基因組的異源四倍體水稻的遺傳多樣性
我們對44份野生水稻種質(zhì)資源進行了重新測序，包括28份CCDD九孩、6份EE和10份CC先馆，共獲得922.45 Gb的序列數(shù)據(jù)(表S1)用于群體基因組分析。每個加入序列的reads與PPR1 V1.0進行比對躺彬，CCDD煤墙、CC和EE的平均mapping率分別為98.47%、88.20%和57.17%(表S1)宪拥。我們發(fā)現(xiàn)了3077萬個高質(zhì)量變異仿野，包括21,281,771個SNPs和9,490,896個indel，平均每千堿基有23.8個SNPs和10.6個indel她君。共有7,373,962個SNPs和3,075,405個indel位于基因區(qū)域脚作，包括1,183,604個非同義變體和288,439個移碼變體。70779個變體具有潛在的巨大影響缔刹，包括54340個SNP和16439個indel球涛，它們會導(dǎo)致引入起始密碼子、過早終止密碼子和轉(zhuǎn)錄本加長桨螺。這些數(shù)據(jù)表明宾符，CCDD種質(zhì)群體內(nèi)部酿秸、Ct和C灭翔、Dt和E基因組之間存在顯著差異。
主成分分析(PCA)顯示辣苏，44個水稻品種明顯聚為3組(圖3A)肝箱，即EE品種的第1組，CCDD品種的第2組稀蟋，CC品種的第3組(圖3B)煌张。通過鄰域連接樹和基于模型的聚類分析，將第2類植物進一步劃分為2個聚類(圖3C和3D)退客，聚類1中有8個大葉扁桃骏融、2個大葉扁桃和4個大葉扁桃，聚類2中有13個大葉扁桃萌狂。CCDD材料的核苷酸多樣性(p)估計為0.0049档玻，低于其他多倍體作物如馬鈴薯(0.0111)，但高于二倍體水稻(O. sativa 0.0024和O. rufipogon 0.0030)茫藏，說明該異源四倍體水稻群體可為今后的功能基因組研究和育種提供豐富的遺傳資源误趴。
2.6異源四倍體O. alta的染色體重排
通過將二倍體CC和EEOryza物種的重測序數(shù)據(jù)與PPR1基因組進行比對，我們能夠確定當(dāng)前的O. alta基因組中哪些部分來自祖先的CC或DD基因組务傲。這顯示了兩個亞基因組四倍體化后大片段的幾次易位(圖3E;表S4)凉当。Ct和Dt基因組2號染色體高度共線（同源基因位于同一條染色體上）枣申，但從CC和EE基因組到PPR1的比對模式清楚地顯示它們之間發(fā)生了大量同源交換(圖3F)。Hi-C熱圖上的連續(xù)相互作用信號以及這些區(qū)域與BioNano地圖的一致性表明看杭，這不是由于組裝錯誤導(dǎo)致的(圖3G和3H)忠藤。
除了同源交換之外，我們發(fā)現(xiàn)與EE 基因組讀數(shù)匹配的 Ct7 上的三個片段與 Ct4 共線泊窘，這表明這些片段是從最初的祖先染色體 Dt4 易位的（圖 3E 和 S5A）熄驼。 Hi-C 熱圖和 BioNano 數(shù)據(jù)再次證實了組裝的正確性（圖 S5B 和 S5C）。同樣烘豹，我們發(fā)現(xiàn)其他幾個片段瓜贾，包括 Dt4 上的一個片段、Dt3 上的一個片段和 Ct1 上的一個片段携悯，分別從祖先染色體 Ct7祭芦、Ct6 和 Dt3 易位。此外憔鬼，我們還鑒定了位于非同源染色體上的 26 個同線塊龟劲，顯然是由 10 個亞基因組內(nèi)易位、4 個染色體內(nèi)重復(fù)和 12 個染色體間重復(fù)引起的（圖 3E轴或；表 S4）昌跌。 Ct11、Ct12 和 Dt11照雁、Dt12 可能經(jīng)歷了多次重復(fù)和易位（圖 3E）蚕愤，但其他六條染色體的染色體重排較少。根據(jù)每個基因上CC和EE物種的匹配讀數(shù)饺蚊，我們進一步鑒定了PPR1基因組中源自祖先CC基因組（祖先CC基因）和祖先DD基因的所有基因萍诱，我們發(fā)現(xiàn)5672個基因（13.04%）現(xiàn)在在 Ct 亞基因組中的基因是 DD 起源的，而 Dt 亞基因組上的 5,132 個基因（13.54%）是 CC 祖先的污呼。同時裕坊，我們發(fā)現(xiàn)四倍體化后大量基因丟失；在當(dāng)前的O. alta 基因組中燕酷，5,516 個祖先 CC 基因沒有祖先 DD 同源物籍凝，3,954 個祖先 DD 基因沒有祖先 CC 同源物。所有這些數(shù)據(jù)表明 O. alta 基因組的高度動態(tài)進化苗缩。
2.7?利用基因組編輯技術(shù)快速馴化PPR1的途徑
在亞洲栽培稻的馴化過程中饵蒂，選擇和改良了有利于耕作而非自然生長的性狀，如直立生長習(xí)性挤渐、稻殼顏色苹享、破碎、芒、果皮顏色和粒級得问，并對其遺傳機制進行了研究囤攀。廣泛研究。野生稻O. alta?具有與現(xiàn)代栽培品種的野生祖先相似的一些特征宫纬。為了快速馴化這些性狀焚挠，我們首先鑒定了二倍體水稻馴化相關(guān)基因的O. alta?同源物（圖 4A），并發(fā)現(xiàn) 10 個重要的馴化相關(guān)基因中有 7 個漓骚，包括脫粒：qSH1蝌衔，芒長度：?An-1?和An-2，外殼顏色：Bh4蝌蹂，果皮顏色：Rc噩斟，圓錐花序形狀：OsLG1?和谷物寬度：GW5，的同源物存在于?O. alta?基因組中孤个，具有 >84% （至少 87.5%）的同一性覆蓋O. sativa?蛋白質(zhì)剃允。PROG1是栽培稻直立生長的關(guān)鍵基因，在O. alta的亞基因組中似乎只有低水平的同源物齐鲤，可能是因為O. alta已經(jīng)具有直立生長習(xí)性斥废。這些馴化相關(guān)基因已暴露于各種進化過程。?Sh4?經(jīng)歷了從 Dt 到 Ct 亞基因組的亞基因組間易位给郊，導(dǎo)致其編碼區(qū)縮短牡肉。?GAD1/RAE2?和OsLG1?的同源物都存在于 Ct 亞基因組中，這是由于一個片段從 Dt 亞基因組易位到 Ct 亞基因組淆九。
作為證明這些同源物的修飾可以真正實現(xiàn)野生?O. alta?快速馴化的概念驗證统锤，我們使用 CRISPR/Cas9 誘變方法來編輯用于脫粒相關(guān)的qSH1?同源物和用于芒長度的An-1同源物。吩屹。我們首先設(shè)計了一個靶向OaqSH1-CC?(OalC01g168290) 和 OaqSH1-DD (OalD01g114050) 的第一個外顯子的sgRNA跪另，并鑒定了一個突變體qsh1CR-1拧抖，它具有 OaqSH1-CC 的雙等位基因移碼突變和雜合移碼OaqSH1-DD?的突變（圖 4B煤搜；表 S6）。我們發(fā)現(xiàn)野生型PPR1在稻粒和花梗之間有一層完整的脫落細(xì)胞唧席，形成類似于野生二倍體稻的縱向連續(xù)線擦盾，而在qsh1CR-1中，沒有脫落細(xì)胞線淌哟，表明編輯 O. alta 中的 qSH1 同源物可以防止種子破碎（圖 4C）迹卢。我們進一步設(shè)計了一個靶向OaAn-1-CC?(OalC04g136090) 和OaAn-1-DD?(OalD04g130280) 的第一個外顯子的 sgRNA 和另一個靶向OaAn-1-DD?的第一個外顯子的 sgRNA，并獲得了一個an-1CR-1?和an-1CR-2?在OaAn1-CC?和OaAn1-DD?中具有不同的純合移碼突變（圖 4D徒仓；表 S6）腐碱。我們發(fā)現(xiàn)an-1CR-1?(1.61 cm) 和an-1CR-2?(2.63 cm) 的平均芒長均明顯短于 PPR1 (4.11 cm) (圖 4E 和 4F)。綜上所述，這些結(jié)果為O. alta的快速馴化提供了堅實的基礎(chǔ)症见。
2.8O.alta?的可變序列與O. sativa農(nóng)藝上重要的基因同源
除了馴化相關(guān)基因外喂走，我們還鑒定了現(xiàn)代二倍體水稻品種中 113 個重要農(nóng)藝基因的O. alta?同源基因，這些基因決定了水稻產(chǎn)量谋作、谷粒質(zhì)量芋肠、肥力、抽穗期遵蚜、生物和非生物抗性等重要性狀帖池，以及養(yǎng)分利用效率（圖 5A；表 S7）吭净。我們發(fā)現(xiàn)影響不同特征的基因具有不同的相似度睡汹。影響O. sativa?不育性的基因在O. alta?中的保守性很差，因為qHMS7寂殉、S5帮孔、SaF、Sc-j?和S1TPR?的最佳匹配同源物的相似性小于 40%不撑，并且沒有可檢測到的 SaM 同源物文兢、WA352 和 pms3（圖 5A；表 S7）焕檬。與生物脅迫相關(guān)的基因的保存也相對較差姆坚，這可能是因為亞洲和美洲的病蟲害不同。相比之下实愚，除了 COLD1和 CAL1之外兼呵，所有與非生物脅迫相關(guān)的基因都高度保守，它們分別負(fù)責(zé)抗寒性和鎘積累腊敲。幸運的是击喂，我們發(fā)現(xiàn)在栽培二倍體和四倍體野生稻之間，與產(chǎn)量碰辅、籽粒品質(zhì)和養(yǎng)分有效利用相關(guān)的大部分基因都相當(dāng)保守懂昂。基于這些發(fā)現(xiàn)没宾，我們進一步測試了這些現(xiàn)代育種基因的同源物是否可以被改變以改良野生異源四倍體水稻凌彬。
綠色革命基因sd1是現(xiàn)代水稻育種中最重要的基因之一，它的突變使水稻莖稈變短循衰，抗倒伏能力提高铲敛，收獲指數(shù)提高。因此会钝，我們針對OaSD1-CC?(OalC01g172060)和OaSD1-DD?(OalD01g109880)的第一個外顯子設(shè)計了兩個sgRNAs伐蒋，獲得了一個在OaSD1-CC和OaSD1-DD中都含有雙等位移碼突變的sd1CR-1突變體(圖5B;表S6)。我們發(fā)現(xiàn)，與野生型PPR1相比先鱼，其高度顯著降低(圖5C)徒蟆。與通常有4 - 5個伸長節(jié)間的O. sativa相比，O. alta有10 - 12個伸長節(jié)間型型。我們對從莖基部開始的前8個節(jié)間長度進行了詳細(xì)的比較段审，發(fā)現(xiàn)在sd1CR-1中，第1和第5節(jié)間的長度相對沒有變化闹蒜，而其他6個節(jié)間的長度都顯著縮短(圖5D和5E)寺枉。其他5個獨立編輯的行也得到了類似的結(jié)果(圖S6A、S6C和S6D;表S6)绷落。此外姥闪，我們還針對二倍體水稻中控制種子形態(tài)的關(guān)鍵基因GS3的同源性設(shè)計了sgRNA，獲得了6個獨立突變體砌烁，與PPR1相比筐喳，它們的籽粒長度顯著增加(圖5F、5G函喉、S6B避归、S6E、S6F;表S6)管呵。這些結(jié)果表明梳毙，在二倍體水稻中獲得的知識可以為野生異源四倍體水稻的改良提供有價值的信息。
2.9用堿基替換編輯器和多重編輯技術(shù)改進PPR1
Ideal Plant?Architecture 1(IPA1)被認(rèn)為是綠色革命的一個新基因捐下，因為該基因的點突變會擾亂OsmiR156靶向位點來調(diào)控其表達(dá)水平, 從而導(dǎo)致莖粗增加账锹、抗倒伏性提高、圓錐花序變大坷襟、顯著提高糧食產(chǎn)量奸柬。我們發(fā)現(xiàn)OamiR156-DD的序列與OsmiR156相同，與OaIPA1- dd上的目標(biāo)位點(OalD08g132520)相匹配婴程，而OamiR156-CC的堿基變化單一廓奕，與OaIPA1- CC(OalC08g106170)相匹配(圖6A和6B)。因此排抬，我們測試了為二倍體水稻優(yōu)化的堿基編輯器是否能在O. alta中產(chǎn)生功能獲得性堿基替代突變懂从，并針對OaIPA1-CC和OaIPA1-DD的miRNA靶點設(shè)計了sgRNA授段。我們獲得了一個突變體ipa1CR-1蹲蒲，該突變體在OaIPA1-DD中含有一個點突變，但不影響OaIPA1-CC(圖6B;表S6)侵贵。對該突變體的詳細(xì)檢測顯示届搁，ipa1CR-1的莖直徑明顯大于PPR1(圖6C 6E)。我們進一步研究了OaIPA1-CC和OaIPA1-DD的轉(zhuǎn)錄變化，發(fā)現(xiàn)在ipa1CR-1的莖基中卡睦，OaIPA1-DD的表達(dá)量增加了10倍宴胧，而OaIPA1-CC的表達(dá)量沒有變化(圖6F)。因此表锻，堿基替換編輯器的使用可以擴展藜麥基因改良的策略恕齐。
水稻抽穗期不像其他性狀通常是單向變化的，在擴大生境瞬逊、不同種植制度和不同日長的育種過程中显歧，抽穗期變化更大。在二倍體水稻中确镊，Ghd7弱等位基因的品種可以在溫帶地區(qū)種植用于糧食生產(chǎn)(翁等士骤，2014;薛等人，2008)蕾域，而在高地理區(qū)域拷肌，低DTH7活性的品種對增加的日長對提早開花的敏感性較低(Gao等人，2014;Yan et al.旨巷， 2013)巨缘。利用CRISPR/Cas9多重編輯方法，在一個載體中加入3個sgRNA 采呐，分別對OaGhd7-CC (OalC07g145340)带猴、OaGhd7-DD (OalD07g113810)、OaDTH7-CC (OalD04g100060)懈万、OaGhd7-CC (OalC07g145340)拴清、OaGhd7-DD (OalD07g113810)、OaDTH7-CC (OalD04g100060)会通、OaGhd7-CC (OalC07g145340)口予、OaGhd7-DD (OalD04g100060)、OaDTH7-CC (OalD04g100060)涕侈、OaGhd7-CC (一個CC祖先基因定位于染色體Dt4)和OaDTH7-DD (OalD07g145130)沪停，共獲得8個T0獨立轉(zhuǎn)化的PPR1株系。我們發(fā)現(xiàn)這8個株系都含有不同的突變等位基因(圖6G;表S6)裳涛，所有4個基因在6個品系中都被編輯過木张，這表明這種技術(shù)在制造PPR1變異方面非常有效。與它們的基因型一致端三，這些編輯株系的標(biāo)題日期變化很大舷礼。4個基因均發(fā)生突變的品系1在北京移植后抽穗期顯著縮短至82天，而野生型PPR1在150天后未能開花郊闯。2號線妻献、3號線在1號線開通10天后開通蛛株，4 - 8號線在103 - 130天后開通。第1 ~ 7行種子可以充種育拨，第8行種子充種失敗谨履，這表明第1 ~ 3行甚至可以在遙遠(yuǎn)的北方地區(qū)播種。更重要的是熬丧，我們還開發(fā)了一個多重編輯系統(tǒng)笋粟，可以以一個單一載體相當(dāng)高效地針對8或16個基因(圖6H和S7;表S6)。綜上所述析蝴，在不久的將來實現(xiàn)野生異源四倍體水稻的快速馴化和改良成為一種主要糧食作物矗钟，在理論和技術(shù)上都是合理的。
Discussion：
多倍體化是植物進化過程中最重要的事件之一嫌变，可以增加植物的遺傳多樣性吨艇，引入新的遺傳組合，促進植物對新環(huán)境的適應(yīng)腾啥，并產(chǎn)生積極的效應(yīng)东涡。大量具有重要經(jīng)濟意義的作物是異倍體；其中包括小麥和燕麥等糧食作物倘待，煙草疮跑、棉花和甘蔗等經(jīng)濟作物以及草莓等水果作物，但其中大多數(shù)是天然異源多倍體物種凸舵。盡管異源多倍體的優(yōu)勢已廣為人知祖娘，但人工誘導(dǎo)的異源多倍體作物很少，通常是通過長期育種計劃篩選出經(jīng)常遇到的不良特征（例如啊奄，小黑麥渐苏，一種源自小麥和黑麥雜交的異倍體作物。我們的目標(biāo)不是在現(xiàn)代作物中誘導(dǎo)異倍體菇夸，而是使用基因組編輯從頭馴化野生異倍體植物琼富。從選擇的野生異源四倍體水稻O. alta基因型PPR1開始，我們建立了高效的組織培養(yǎng)和基因組編輯系統(tǒng)庄新，并產(chǎn)生了高質(zhì)量的基因組組裝鞠眉。通過利用栽培二倍體水稻中經(jīng)過充分研究的馴化相關(guān)基因，我們在 O. alta 基因組中鑒定了它們的同源物择诈，為編輯其潛在重要的農(nóng)藝基因提供了必要信息械蹋。然后，我們應(yīng)用 CRISPR/Cas9羞芍、堿基編輯和多重編輯技術(shù)哗戈，通過編輯一系列在二倍體水稻中馴化相關(guān)和/或農(nóng)藝學(xué)上重要的基因來改進 PPR1，其中我們獲得了具有所需特征的編輯系涩金，包括種子脫粒谱醇、芒長度暇仲、株高步做、粒度副渴、莖粗和抽穗日期。目前的工作為實現(xiàn)野生異源四倍體水稻快速從頭馴化的技術(shù)難題提供了有效的解決方案全度。我們展示了野生種質(zhì)的使用煮剧、完整的參考基因組罐韩、改進的轉(zhuǎn)化方案和多樣化的基因組編輯工具台谊，以創(chuàng)造新的作物物種。此后牺氨，仍需要巨大的努力和投資才能在農(nóng)民田間種植新作物品種方面取得最終成功顶掉。首先草娜，盡管在野生異源四倍體水稻中已經(jīng)克服了轉(zhuǎn)化和基因組編輯的障礙，但許多等位基因需要弱效應(yīng)而不是完全敲除才能產(chǎn)生最理想的性狀痒筒。為此宰闰，仍然迫切需要用于產(chǎn)生各種修飾的高效基因組編輯工具。其次簿透，涉及的基因通常具有多效性移袍，編輯等位基因不同組合的結(jié)果難以預(yù)測。因此老充，需要更多的遺傳多樣性來實現(xiàn)優(yōu)化工程等位基因的育種計劃葡盗。第三，與栽培稻相比啡浊，野生稻在生物和非生物脅迫抗性等性狀方面具有許多優(yōu)勢觅够，這是應(yīng)對即將到來的氣候變化挑戰(zhàn)的關(guān)鍵因素。因此巷嚣，人們對表征野生稻的這些性狀和探索分子標(biāo)記引導(dǎo)下與野生稻雜交的能力有著巨大的興趣蔚约。。不幸的是涂籽，由于不僅缺乏基因組信息和轉(zhuǎn)化系統(tǒng)苹祟，而且難以構(gòu)建新的遺傳種群和反映這些理想性狀的復(fù)雜性，野生稻的基因克隆比栽培稻要困難得多评雌。因此树枫，在不完全了解其機制的情況下，將需要經(jīng)典育種來維持這些性狀景东。第四砂轻，由于野生異源四倍體水稻種群具有更高的遺傳多樣性，它們?yōu)槲磥淼墓δ芑蚪M研究提供了可利用的天然遺傳資源斤吐，并在新的育種計劃中用作雜交搔涝。
在過去的幾十年里厨喂，隨著栽培水稻中許多關(guān)鍵基因的克隆，水稻功能基因組學(xué)研究取得了重大進展庄呈。通過雜交組合來自不同栽培品種的重要等位基因蜕煌，這極大地有利于水稻育種。水稻的一個成功例子是開發(fā)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)水稻新品種诬留。目前斜纪，已經(jīng)組裝了三個二倍體（AA、BB 和 FF）水稻基因組文兑，但只有 AA 物種具有高質(zhì)量的假染色體水平基因組盒刚。為多倍體基因組生成高質(zhì)量的基因組組裝是一項挑戰(zhàn)，尤其是在區(qū)分同源亞基因組方面绿贞。許多商業(yè)上重要的異源多倍體和同源多倍體作物已經(jīng)被測序和組裝因块，例如小麥、油菜籍铁、甘薯涡上、甘蔗?和畫眉草contig N50 范圍從 480 bp 到 5 Mb。從我們的研究經(jīng)驗來看寨辩，優(yōu)秀的裝配體吓懈、充足的超長讀碼測序數(shù)據(jù)、不同測序策略的組合以及選擇雜合度低的好材料是裝配多倍體基因組的關(guān)鍵靡狞。高質(zhì)量的O. alta基因組將為四倍體水稻的分子遺傳學(xué)研究耻警、Oryza物種的進化以及高等植物多倍體化的分子機制提供有力的工具〉榕拢總之甘穿，通過結(jié)合（1）多倍體的優(yōu)勢，（2）栽培作物的功能基因組學(xué)知識梢杭，從頭馴化野生異源四倍體水稻 O. alta 的策略為未來創(chuàng)造新型作物提供了明確的途徑温兼，（3）野生物種的理想屬性，以及（4）通過基因組編輯進行快速基因改造武契。
寫在最后：
看完整篇文章募判，感覺生物信息學(xué)的手段已經(jīng)是每個生物人無法繞過的一個事情，生物信息學(xué)現(xiàn)在越來越像分子克隆咒唆，western blot等一樣成為每個想學(xué)好生命科學(xué)的研究生必須學(xué)習(xí)的一門技術(shù)届垫。自己最近趁著疫情開始學(xué)習(xí)生信中R語言的一些簡單應(yīng)用，希望這是一個好的開始全释，自己將來做不到數(shù)據(jù)自己就能分析的水平装处，也能知道自己的數(shù)據(jù)到手，去哪里抄點腳本照貓畫虎也是好的浸船。
