A Comprehensive Proteomic and Phosphoproteomic Analysis of Retinal Pigment Epithelium Reveals Multiple Pathway Alterations in Response to the Inflammatory Stimuli

視網膜色素上皮的全面蛋白質組和磷酸化蛋白質組學分析揭示了對炎癥刺激的多種途徑改變

期刊：Int J Mol Sci (IF = 4.556)?

發(fā)表單位：首爾國立大學

導 讀

????RNAsesq盛泡，蛋白質組學，磷酸化組學等組學分析文章是很常見的娱颊，但大多影響因子較低傲诵，為什么，我們看看這篇文章是怎么做的箱硕。

摘 要

視網膜色素上皮（RPE）持續(xù)性炎癥會引起視網膜環(huán)境的破壞性變化拴竹，但是確切的機制仍不清楚剧罩。在這項研究中栓拜，旨在研究針對強烈炎癥的RPE特異性生物學和代謝反應，并確定決定病理進展的分子特征惠昔。使用最新的等壓串聯(lián)質譜標簽（TMT）標記方法對脂多糖（LPS）處理45分鐘至24小時后幕与，對人源RPE細胞系ARPE-19的蛋白質組和磷酸化蛋白質組進行了定量分析镇防。共鑒定了8984種蛋白質啦鸣，其中LPS處理24小時后261種蛋白質的豐度變化了1.5倍。磷酸化蛋白質組分析確定了來自3207個磷蛋白的20632個獨特的磷肽来氧，具有3103個磷酸化位點诫给。蛋白質組學和磷酸化蛋白質組學的綜合分析顯示，LPS刺激后中狂，與線粒體呼吸作用和細胞周期檢查點相關的蛋白質顯著下調凫碌，而與脂質代謝、氨基酸代謝胃榕、細胞基質粘附和內質網（ER）應激相關的蛋白質上調盛险。此外，已確定包括MAPKK和Wnt /β-catenin信號傳導在內的多種途徑的磷酸化事件均與LPS觸發(fā)的病理生物學有關勋又。從本質上講枉层，本研究的發(fā)現(xiàn)揭示了RPE在炎癥下施加的多種整合信號，并有望為RPE疾病治療干預的發(fā)展提供見識鸟蜡。

前 言

????視網膜色素上皮（RPE）是位于視網膜和脈絡膜之間的六邊形色素細胞層。許多研究指出挺邀，由復雜的生物紊亂引起的持續(xù)性炎癥揉忘，會刺激免疫細胞的募集和活化，加劇新陳代謝端铛，導致RPE的病理生物學變化泣矛。但是，尚不清楚導致RPE發(fā)生這些破壞性變化的確切機制禾蚕，必須進一步了解確定疾病進展的RPE特異性炎癥反應您朽。

????高靈敏度串聯(lián)質譜標簽（TMT）標記方法與高分辨率質譜聯(lián)用是最近開發(fā)的蛋白質組技術，可以識別數千種蛋白質哗总，具有更高的覆蓋率和準確性。本研究通過對源自人的RPE細胞系ARPE-19進行基于TMT標簽的定量分析倍试，試圖闡明脂多糖（LPS）誘導的炎癥細胞中蛋白質組和磷酸化蛋白質組中的差異表達模式讯屈，并鑒定異常途徑如何誘導RPE變性表型。

方 法

????在指定的時間內（45分鐘和24小時县习；n = 3）用不同濃度的脂多糖（LPS）刺激ARPE-19細胞涮母，進行下游蛋白質組學和磷酸化蛋白質組學分析。

????使用Perseus軟件進行蛋白質組學數據的統(tǒng)計分析躁愿。t檢驗用于鑒定蛋白質表達的統(tǒng)計學顯著性差異叛本，以及分析磷酸蛋白質組數據集的磷酸化水平的統(tǒng)計學顯著性差異水平彤钟。對于分層聚類分析来候，使用單因素方差分析進行了多個樣本檢驗。使用Cytoscape工具ClueGO插件實現(xiàn)基因本體（GO）注釋和途徑富集分析样勃》涂保基因集富集分析（GSEA）分析蛋白質定量數據峡眶，并以密度圖顯示了相對于整個數據集的基因集豐度剧防。使用STRING數據庫分析差異蛋白質組和磷酸化蛋白質組中蛋白質相互作用網絡分析。

????更詳細的材料和方法可以在在線補充材料中找到辫樱。

結 果

1??誘導炎癥的ARPE-19蛋白質組學（描述細胞模型）

????為了確定可引起RPE代謝和促炎反應的脂多糖（LPS）濃度峭拘，使用不同濃度的LPS評估了細胞外酸化率（ECAR）/耗氧率（OCR）和炎性細胞因子水平，炎癥驅動的病理進展已在24小時內開始狮暑。LPS處理后30分鐘至1小時之間顯示出明顯的代謝變化鸡挠，這意味著在這兩個時間點之間已經開始了重要的信號級聯(lián)反應。

通過細胞動力學評估搬男，作者將45分鐘時用于早期信號轉導事件，在24小時時用于后期蛋白質組變化缔逛。

圖1备埃，工作流程，研究脂多糖（LPS）刺激的ARPE-19蛋白質組和磷酸化蛋白質組褐奴。（A）極化的ARPE-19細胞的免疫熒光圖像按脚，顯示ZO-1（紅色）和RPE65（綠色）或Na + K + ATPase（綠色）；（B敦冬，C）實時測量細胞外酸化率（ECAR）和耗氧率（OCR）辅搬，以評估ARPE-19細胞對不同濃度LPS的代謝反應；（D）用于LPS處理的ARPE-19細胞的基于串聯(lián)質譜（TMT）的蛋白質組/磷酸化方法的流程脖旱。

2??定量蛋白質組學和磷酸化蛋白質組學分析（整體描述組學數據）

隨后是對蛋白組和磷酸化蛋白組的整體概況，包括鑒定蛋白的數量萌庆，差異蛋白數量等蚤氏。

????相關性或主成分分析（PCA）均顯示出良好的生物學重復，以及組間差異踊兜。8984個蛋白中鑒定出130878個獨特的肽竿滨，平均序列覆蓋率為31％，有261種蛋白質差異表達捏境。從具有3103個磷酸化位點的3207個磷蛋白中鑒定出20632個獨特的磷酸肽于游，發(fā)現(xiàn)2561個蛋白質在蛋白質和磷酸化蛋白質之間重疊。大多數磷蛋白在早期或晚期時間點均不受LPS刺激的顯著影響贰剥，因為平均log2倍變化集中在零附近。

圖2筷频，LPS刺激的ARPE-19蛋白質組和磷酸化蛋白質組的概述蚌成。（A）蛋白組和磷酸蛋白組的主成分分析（PCA）前痘；（B，C）蛋白質組和磷酸蛋白質組譜概述担忧；（D）蛋白質組和磷酸蛋白質組鑒定出的蛋白重疊芹缔；（E）對數倍數變化分布直方圖月杉；（F）差異表達分析火山圖十绑。

3??鑒定蛋白質的功能注釋（蛋白質組學功能富集分析）

為了研究與炎癥驅動的病理學相關的生物學過程捕犬，進行了層次聚類和基因本體（GO）富集分析桂塞。45分鐘的差異蛋白數量較少嘁灯，通路富集不明顯对碌。24小時的4192個差異蛋白的GO分析顯示帝璧，與線粒體代謝和細胞周期檢查點有關的蛋白質下調轧房，脂質和氨基酸代謝的擾動以及細胞-基質粘附拌阴、內質網（ER）應激和外在凋亡信號上調。

為了獲得與差異表達模式相關的功能性蛋白質譜奶镶，還使用基因集富集分析（GSEA）迟赃。在重大的代謝擾動中实辑，研究中的153種上調和下調蛋白調節(jié)的兩個重要途徑捺氢，白細胞穩(wěn)態(tài)和細胞-基質粘附。在RPE中剪撬，高遷移率族框1（HMGB1）和缺氧誘導因子1α（HIF1α）作為RPE中的促血管生成和促炎因子摄乒，在炎癥過程豐度增加残黑。細胞內粘附分子1（ICAM-1）馍佑、纖連蛋白1（FN1）、纖維蛋白-1（FBN1）和血小板反應蛋白1（THBS1）與細胞粘附有關梨水，尤其是在高危RPE中上調拭荤∫叻蹋基質金屬肽酶14（MMP14）強烈下調舅世，它是維持Bruch膜（BrM）的結構元素，結締粘附分子3（JAM3）的合成和分解之間的生理平衡的關鍵酶奇徒，調節(jié)N的募集 -鈣黏著蛋白和ZO-1形成緊密連接雏亚，也因炎癥而減少摩钙。（列舉一些重要作用的蛋白或通路罢低，簡述功能和表達量改變的關系）

圖3，差異蛋白質的功能分析胖笛。（A）LPS處理24 h后差異表達的蛋白質的層次聚類网持，并展示其富集的術語；（B）GSEA的高貢獻蛋白質熱圖功舀。

4??磷酸化蛋白質組分析（磷酸化組學數據分析）

進一步研究由蛋白質磷酸化和去磷酸化調控的LPS誘導的信號通路萍倡，聚類分析揭示了磷酸化進程的三種不同模式。簇1的差異磷酸化肽富集了膽固醇代謝日杈、細胞衰老遣铝、細胞基質粘附和細胞死亡過程佑刷。簇2包括蛋白激酶活性莉擒、細胞對DNA損傷的反應以及對細胞因子的反應。簇3涉及p38 MAPK級聯(lián)反應和β-catenin-TCF復合物組裝瘫絮。

并列舉一些參與重要通路的蛋白涨冀，簡述關鍵蛋白成分的磷酸化狀態(tài)麦萤。參與NF-κB活化的蛋白激酶Cδ（PRKCD）在殘基Ser-304處被磷酸化鹿鳖。β-catenin（CTNNB1）通過與NF-κB的串擾參與炎癥調節(jié)，在殘基Ser-552處被磷酸化壮莹。occludin（OCLN）的磷酸化已知發(fā)生在維持緊密連接完整性上翅帜，被鑒定為在殘基Ser-321處明顯去磷酸化命满。

圖4涝滴，磷酸化蛋白的功能分析。（A）LPS處理45分鐘和24小時后顯著改變的磷酸酯的層次聚類胶台，并展示其富集的術語歼疮；（B）在三個時間點顯著改變的41個磷酸位點的磷酸化狀態(tài)诈唬。

5??蛋白質相互作用網絡

構建了蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡韩脏，整合有關蛋白質豐度、激活狀態(tài)和分子相互作用的信息铸磅，以確定蛋白質組學和磷酸化蛋白質組學在炎癥驅動的發(fā)病機理中的復雜相互作用赡矢。重點研究了基于GSEA和GO富集選擇的106個關鍵的差異蛋白和30個差異磷酸蛋白。網絡中包含136個節(jié)點和1094個邊吹散，表明它們是多功能的且相互依賴，并富集了RPE病理生物學密切相關的16個GO生物學過程術語霎槐。

圖5送浊，與ARPE-19細胞炎癥驅動的病理相關的蛋白質的網絡分析；圓圈表示差異蛋白丘跌，菱形表示差異磷酸蛋白袭景。

討 論

????該項研究中通過蛋白質組和磷蛋白定量分析唁桩，創(chuàng)建視網膜色素上皮（RPE）中炎癥驅動的生物和代謝變化的全局概述。在脂多糖（LPS）誘導炎癥的ARPE-19細胞中總共鑒定出4490個差異表達蛋白和1561個差異磷酸化蛋白耸棒。發(fā)現(xiàn)與線粒體呼吸荒澡、細胞周期檢查點和抗氧化系統(tǒng)有關的蛋白質顯著下調与殃，被認為與脂類代謝单山、氨基酸代謝、內質網應激幅疼、細胞-基質相互作用和細胞凋亡的強烈擾動有關米奸。與MAPKK途徑爽篷，Wnt /β-catenin途徑和I-κB/NF-κB信號傳導有關的早期磷酸化事件悴晰，以及隨后與細胞衰老和細胞-基質粘附相關的蛋白質的磷酸化/去磷酸化被確定與發(fā)病機理有關。

點評：這篇文章用的3個時間點逐工，做了蛋白質組學铡溪，磷酸化組學研究，不涉及其他的實驗棕硫。數據分析也只是描述測序數據，差異的蛋白袒啼，對蛋白及位點稍作延伸哈扮，做了常規(guī)的GO/KEGG分析。是一篇比較典型的組學分析思路瘤泪。

缺點：

1）只討論自己的數據灶泵，如果與前人研究做些對比，類似模型的RNAseq數據对途，蛋白赦邻，代謝甚至是重要的突變基因等數據，做做比較实檀，找找數據的相關性，揭示共同點與不同點膳犹，文章的價值會增加不少恬吕。

2）缺乏機制的關聯(lián)，這里僅關聯(lián)了通路须床，沒有深入到通路內部铐料，揭示蛋白與底物等關系對，如果能找到一兩個核心的通路或者機制（來源文獻），整理一下激酶與底物的關系钠惩，概括出磷酸化的變化是哪些激酶作用的結果柒凉，及該變化可能會引起的信號軸的變化，提出一個信號軸篓跛，該文章的價值會得到極大的提升。

3）蛋白質譜與磷酸化的關聯(lián)較少愧沟，這里提到了兩點蔬咬，應該重點討論，兩者是如何共同發(fā)揮功能的沐寺，是否有蛋白未改變林艘，而磷酸化改變的這樣的蛋白芽丹。是否可以討論呢卜朗，總之可以分析討論的地方很多....