B淋巴細胞亦可簡稱B細胞，是來源于骨髓（bone-marrow）的多能干細胞谚赎，所以稱為B細胞淫僻。其分化過程可分為前B細胞、不成熟B細胞壶唤、成熟B細胞雳灵、活化B細胞、漿細胞等五個階段闸盔。成熟的B細胞主要存在于淋巴結(jié)皮質(zhì)淺層和脾臟的紅髓和白髓的淋巴小結(jié)內(nèi)悯辙。B細胞在抗原刺激下可分化為漿細胞，漿細胞可合成和分泌抗體（免疫球蛋白）迎吵，主要執(zhí)行機體的體液免疫（humoralimmunity）躲撰。近年來，隨著生命科學和醫(yī)學行業(yè)的興起击费，人類對于疾病與健康更加關(guān)注拢蛋，對于直接關(guān)乎機體的免疫功能的B細胞而言，其研究愈加火熱蔫巩。
眾所周知谆棱，B細胞很難操縱快压，在靜息狀態(tài)下特別脆弱，這使得調(diào)節(jié)其基因內(nèi)源性表達或誘導轉(zhuǎn)基因過度表達變得非常困難垃瞧。人類B細胞可以通過使用病毒載體進行操縱蔫劣，然而該方法有諸多缺點。為了便于研究人類B細胞在健康和疾病環(huán)境中的基因功能个从，迫切需要穩(wěn)健的遺傳操作方案脉幢。近日，意大利錫耶納大學嗦锐，醫(yī)學嫌松、外科和神經(jīng)科學學院的 Federica Nardi和Laura Pezzella等人在European Journal of Immunology期刊上發(fā)表了題為Assessing gene function in human B cells: CRISPR/Cas9-based gene editing and mRNA-based gene expression in healthy and tumor cells 的技術(shù)報道類研究論文筹燕。在本研究中犁苏，作者建立了分別從健康人和血液病患者分離出的原代B細胞中進行高通量mRNA驅(qū)動的轉(zhuǎn)基因表達和基于CRISPR/Cas9的基因敲除流程∷露基于靜息狀態(tài)下的人體B細胞進行電穿孔實驗的穩(wěn)健操作方案菊值，克服了B細胞難操縱的障礙外驱，這將顯著加速B細胞研究的潛力。
mRNA在傳遞中作為質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的一種無毒替代物腻窒，已應用于一系列脆弱的原代細胞昵宇。體外重組純化的Cas9和合成的sgRNA形成的核糖核蛋白（RNP）復合物的電穿孔是一種易于設計的CRISPR/Cas9基因編輯。
在本次實驗中儿子，研究人員使用NEPA21基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)對來源于健康人和血液病患者分離出的原代B細胞進行電穿孔實驗并將攜帶綠色熒光蛋白的mRNA導入到細胞內(nèi)瓦哎，用以觀察基因的表達和轉(zhuǎn)染效率。研究人員設置了12次電穿孔條件柔逼，最佳的條件使的在電轉(zhuǎn)后B細胞的存活率>90%蒋譬，mRNA的轉(zhuǎn)染效率>90%（圖1A–C）。解凍冷凍保存的B細胞也觀察到相似的電穿孔效率（>90%）愉适，但其細胞存活率稍低（85%）犯助，從而證實電穿孔條件與細胞冷凍保存條件相容。蛋白質(zhì)過度表達可以通過調(diào)節(jié)mRNA劑量輕松控制（圖1D）维咸，通常在電穿孔后96小時通過綠色熒光蛋白反應才能檢測到結(jié)果（圖1E）剂买。我們還檢測了通過尿苷-上半尿苷替代導致mRNA免疫原性降低的mRNA結(jié)構(gòu)的化學修飾是否會對B細胞轉(zhuǎn)染效率產(chǎn)生積極影響。然而癌蓖，我們沒有觀察到使用含尿苷的mRNA的顯著優(yōu)勢瞬哼。
隨著電轉(zhuǎn)技術(shù)在B細胞的應用與發(fā)展，研究人員建立了一條分子生物學實驗線租副，允許以高通量的方式過度表達編碼大量轉(zhuǎn)基因的mRNA坐慰。研究者們建立了一個5步法程序，以產(chǎn)生以96孔格式編碼任何給定轉(zhuǎn)基因的mRNA（圖1F）用僧。它包括（1）基因特異性引物的自動設計讨越，（2）從任何合適模板擴增轉(zhuǎn)基因的第一個PCR反應两残，（3）將純化的PCR產(chǎn)物Gibson連接到含有體外轉(zhuǎn)錄所需元素的修飾的dRNA2支架上[2]
（4） ，第二次PCR擴增與轉(zhuǎn)基因C末端的FLAG標簽融合的體外轉(zhuǎn)錄模板把跨，以及（5）mRNA的體外合成。這種方法可以快速沼死、廉價地生產(chǎn)出純化的mRNA為電穿孔做準備着逐。為了進行實驗驗證，可以通過使用抗Flag標簽抗體（圖1G）進行免疫印跡來方便地驗證轉(zhuǎn)基因過表達意蛀，經(jīng)驗證耸别，mRNA電穿孔B細胞可用于任何體外或體內(nèi)檢測。
圖1：人體B細胞中基于mRNA的轉(zhuǎn)基因過表達县钥。（A）B細胞電穿孔后的活力和轉(zhuǎn)染效率秀姐。用5μg GFP mRNA和100μL體積的B細胞進行電穿孔實驗，并在AIM-V中培養(yǎng)過夜若贮。最佳設置以黃色突出顯示省有。（B）流式細胞儀分析結(jié)果和（C）B細胞的活力和轉(zhuǎn)染效率，按最佳設置（n=6次實驗）進行谴麦。（D） 使用不同劑量的GFP mRNA進行B細胞電穿孔的示例蠢沿，顯示轉(zhuǎn)基因過度表達如何通過mRNA劑量進行微調(diào)。（E） 電穿孔后24和96小時mRNA電穿孔B細胞中綠色熒光蛋白信號的流式細胞術(shù)分析匾效。面板（D）和（E）是代表至少三個獨立實驗舷蟀。（F） 體外進行mRNA合成及擴增的工作流程。（G）體外mRNA的產(chǎn)生和免疫印跡的示例圖（IB）電穿孔后24小時面哼，在B細胞中檢測到的FLAG標記的轉(zhuǎn)基因野宜。
此外，為了開發(fā)B細胞中KO基因的管道魔策，研究人員優(yōu)化了培養(yǎng)實現(xiàn)穩(wěn)健的B細胞增殖的條件匈子，這是實現(xiàn)基于Cas9的基因編輯的高效性所必需的，對于活力和增殖能力低的B細胞（如CLL細胞）來說尤其具有挑戰(zhàn)性代乃。我們觀察到B細胞對細胞擁擠效應特別敏感旬牲，必須以不超過1—2×105個細胞/mL的密度進行電轉(zhuǎn)。在通過BCR搁吓、CD40和IL-4/IL-21刺激B細胞以及對培養(yǎng)物基中細胞板數(shù)的優(yōu)化原茅，使我們能夠在5-6天內(nèi)對所有測試樣本實現(xiàn)三到五輪細胞分裂。
為了通過CRISPR/Cas9方法建立B細胞KO基因的方案堕仔，如圖2A所示的流程擂橘。研究人員用較穩(wěn)定的聚谷氨酸RNPs電穿孔B細胞，并使其在電穿孔后5-6天內(nèi)增殖摩骨，這通常使我們在大量人群中獲得>70%的基因KO（圖2B和C）通贞。KO表型可在電穿孔后第3天觀察到朗若，并在B細胞內(nèi)擴增后進一步增強（圖2D和E）。靶向CD19基因被證明是有用的內(nèi)部控制昌罩，可通過流式細胞術(shù)進行簡單評估（圖2B）哭懈，而敲除細胞周期調(diào)節(jié)因子CDC5L（可導致B細胞分裂停滯）可作為B細胞增殖試驗的對照（圖2F）【ビ茫總之遣总，我們的結(jié)果表明，為了在靜息B細胞中實現(xiàn)CRISPR/Cas9高靶向效率轨功，有必要且足夠的使用優(yōu)化的電穿孔（NEPA21基因高效轉(zhuǎn)染系統(tǒng)）條件來遞送Cas9 RNP旭斥，然后培養(yǎng)B細胞以誘導其增殖。
圖2：人體B細胞中基于Cas9 RNP的KO基因古涧。（A） 人體B細胞中基于CRISPR/Cas9的基因編輯工作流程垂券。（B） 代表性實驗和（C）顯示RNP切除后第5天B細胞表面受體CD19（n=10）或ILT3/LILRB4（n=6）KO的實驗總結(jié)。（D） 電穿孔后72小時和120小時羡滑，B細胞中CD19 KO的分析菇爪。（E）面板D中： CD19染色組織覆蓋情況。（F）CDC5L KO后阻斷B細胞增殖啄栓。數(shù)據(jù)點為平均值±SD娄帖。（D–F）所示數(shù)據(jù)代表五個（D，E）和三個（F）獨立實驗**p<0.01昙楚，****p<0.0001（Mann–Whitney檢驗）
?最后近速，為了使該方法適用于高通量篩選程序，研究者們建立了30 μL電穿孔體積的電穿孔條件堪旧，其中所有試劑和細胞數(shù)量按比例縮小削葱。這種方案降低了對細胞和試劑的消耗，同時實現(xiàn)基因過度表達和基因KO的高效率淳梦。因此析砸，本研究中的方法學流程闡明了一種可擴展的方法就是利用體外生產(chǎn)的mRNA或合成的靶向RNA序列評估不同來源的靜息人類B細胞的基因功能。該流程的優(yōu)點包括在不影響細胞的存活率和不需提前擴增的情況下爆袍，能夠以高通量方式評估人的原代B細胞中的基因功能首繁，并且可以直接在大量人群中進行應用。還提出了另一個工作流程陨囊，就是類似的方案也適應于其他電穿孔系統(tǒng)弦疮，并最終適應其他類型的脆弱原代免疫細胞。
論文鏈接
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/eji.202149784
參考文獻
1蜘醋、Nardi, F., Pezzella, L., Drago, R., Di Rita, A., Simoncelli, M., Marotta, G., Gozzetti, A., Bocchia, M. and Kabanova, A. (2022), Assessing gene function in human B cells: CRISPR/Cas9-based gene editing and mRNA-based gene expression in healthy and tumor cells. Eur. J. Immunol., 52: 1362-1365.?https://doi.org/10.1002/eji.202149784
2胁塞、 Vriens, K. et al., Nature. 2019. 566: 403–406.
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