那么诀拭，在進行單細胞測序中有哪些質(zhì)控點需要注意呢？下面我們以單細胞轉(zhuǎn)錄組實驗為例煤蚌，一起打卡單細胞建庫測序過程中的“優(yōu)質(zhì)連環(huán)扣”耕挨。

組織樣品質(zhì)控環(huán)節(jié)

在單細胞測序?qū)嶒炦^程中，樣品采集與保存是實驗成功的基礎(chǔ)铺然，也是保證實驗成功的第一步。一個合格的組織樣品需同時滿足：①離體時間較短酒甸，通常小于72 h魄健；②保存溫度2-8 ℃；③樣本質(zhì)量大于100 mg插勤，象形的比喻是“黃豆凉潦荩”大小的組織塊。因此农尖，我們需要將離體的組織盡快進行細胞懸液制備及下游單細胞實驗析恋，以保證組織細胞中的核酸信息不發(fā)生變化。

然而在具體實踐中盛卡，由于取樣場所條件的不同助隧，很難實現(xiàn)第一時間組織解離和單細胞實驗。為了能保持細胞活性滑沧，可以考慮使用組織保存液對組織短時間保存并村，預(yù)留出時間將組織樣本運輸?shù)街行膶嶒炇椅∈怠Ｐ赂裨鶕?jù)這一需求開發(fā)了sCelLive?組織保存液，可以保存組織72小時的活性哩牍，且不影響細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄本變化棚潦。

細胞懸液質(zhì)控環(huán)節(jié)

取得合適的組織樣品后，要對組織樣品進行解離以獲得單細胞懸液膝昆。目前解離方式有多種多樣丸边，如機械研磨、酶促解離等荚孵。為了幫助實驗人員更好解離樣品妹窖，新格元同時推出sCelLive?組織解離液可搭配Python?自動化組織解離儀，從而快速的將組織解離成單細胞懸液并保持細胞的活性处窥。

對于組織解離出來的細胞懸液嘱吗，其質(zhì)控主要采取對細胞懸液進行臺盼藍染色觀察為主。若組織塊消化完全滔驾，顯微鏡下觀察細胞無成團或聚集現(xiàn)象谒麦，細胞懸液即為達標；同時單細胞實驗要求細胞懸液符合以下標準：①細胞活性>85%哆致；②細胞總數(shù)> 20000绕德；③雜質(zhì)或紅細胞占比小于20%

圖2 細胞懸液的鏡檢結(jié)果

對于離心重懸后的獲取到的細胞懸液，如果紅細胞占比大于20%摊阀，則需要進行紅細胞裂解步驟耻蛇，裂紅后細胞懸液需通過鏡檢判斷紅細胞是否裂解徹底，若紅細胞數(shù)量依然大于20%胞此，則需要二次裂紅處理臣咖；若紅細胞占比小于10%可以直接清洗重懸鏡檢。? ??

?文庫構(gòu)建環(huán)節(jié)

優(yōu)質(zhì)的單細胞懸液經(jīng)微流控芯片分離和分子標簽磁珠核酸捕獲之后漱牵，即可獲取到單細胞的mRNA夺蛇，并經(jīng)過經(jīng)反轉(zhuǎn)錄擴增（RT-PCR）得到單細胞的cDNA，我們可以通過cDNA的長度推測單細胞mRNA的捕獲質(zhì)量酣胀。

為滿足二代測序?qū)y序文庫長度的要求（通常采用PE150測序）刁赦，質(zhì)檢合格的cDNA需要進行片段化（Fragment）打斷成約500bp左右的片段，并經(jīng)過末端修復(fù)闻镶、加接頭甚脉、PCR擴增、片段分選等常規(guī)NGS建庫操作得到cDNA文庫铆农。

純化后cDNA和核酸文庫可以用Qubit及生物片段分析儀檢測其濃度和片段大小牺氨。一個合格的cDNA應(yīng)同時滿足以下條件：①Q(mào)ubit檢測總量＞30ng；②質(zhì)檢主峰片段大小應(yīng)在 900-2000bp左右；③ 1000bp-5000bp占比大于15%波闹；④300bp以下片段占比小于40%酝豪；一個合格的核酸文庫應(yīng)同時滿足以下條件：①Q(mào)ubit檢測總量>100ng；②質(zhì)檢主峰400bp-700bp之間精堕；③900bp-5000bp占比<10%孵淘。

NGS下機數(shù)據(jù)分析環(huán)節(jié)

文庫構(gòu)建完成并成功上機測序象征著單細胞測序即將進行到數(shù)據(jù)挖掘階段。根據(jù)高通量測序原理歹篓，測序過程中產(chǎn)生的代表堿基信息的光學(xué)信號經(jīng)堿基識別（base calling）分析轉(zhuǎn)化為堿基信息（reads）瘫证。在單細胞測序核酸捕獲與文庫構(gòu)建過程中，我們添加了帶有獨特細胞標簽的Barcode Beads用來標記細胞身份庄撮，因此需要根據(jù)標簽序列將對應(yīng)的樣品進行拆庫定量背捌。FASTQ是大多數(shù)測序平臺下機后的原始數(shù)據(jù)文件格式。

圖3 FASTQ文件格式（Illumina文庫）

在單細胞數(shù)據(jù)分析過程中洞斯，我們同樣需要對下機的原始數(shù)據(jù)（raw data）進行一系列嚴格的質(zhì)控標準毡庆，即去除低質(zhì)量序列，保留好的序列以保證最終分析獲得的數(shù)據(jù)結(jié)果真實烙如、可靠么抗。在此基礎(chǔ)上，單細胞測序質(zhì)控包括：read1 barcode質(zhì)控亚铁、read2質(zhì)控蝇刀、比對質(zhì)控、細胞質(zhì)控徘溢。這些質(zhì)控過程已被整合到新格元的Celescope?可視化分析軟件中吞琐，該軟件可以對下機數(shù)據(jù)進行自動標簽糾錯和參考基因組比對，進而生成表達矩陣和單細胞質(zhì)控結(jié)果然爆。

圖4 Celescope?可視化分析軟件工作流程

下面是單細胞測序質(zhì)控報告中一些關(guān)鍵參數(shù)希望大家注意：

>Uniquely Mapped Reads：與基因組專一比對的reads數(shù)站粟，主要范圍70%-90%。

>Fraction Reads in

Cells：帶有細胞相關(guān)barcodes且唯一比對到轉(zhuǎn)錄組的reads（百分比較低意味著細胞中瀕死或死亡細胞RNA比例較高）曾雕，主要范圍>50%奴烙。

>Median UMI per Cell：每個細胞相關(guān)barcodes的UMI計數(shù)中位值，與測序深度有關(guān)翻默。

>Median Gene per Cell：每個細胞相關(guān)barcode中檢測到的基因中位數(shù)缸沃，與測序深度有關(guān)恰起。

>Mean Reads per Cell：常用來表示測序深度修械，有效reads（valid reads）的數(shù)量除以估計的細胞數(shù)（Estimated Number of Cells）。

>Saturation：即測序飽和度检盼，其大小和測序深度有關(guān)肯污，也和文庫復(fù)雜度有關(guān)，一般測90G之后>60%。

實驗示例

我們以小鼠黑色素瘤PDX模型樣本和GEXSCOPE?海量單細胞轉(zhuǎn)錄組試劑盒為例蹦渣，進行完整的單細胞建庫測序?qū)嶒灐?/p>

首先在得到樣品后哄芜，我們使用組織解離液獲取到細胞懸液，并通過微流控芯片獲取到高質(zhì)量的cDNA和核酸文庫柬唯，最終獲得的單細胞下機數(shù)據(jù)經(jīng)Celescope?可視化分析軟件進行分析认臊。

可以看到，此次實驗獲得了9446有效單細胞锄奢，細胞活性91%失晴，單細胞獲取情況良好。cDNA片段大小在1000-2000bp保證得到cDNA全長拘央；轉(zhuǎn)庫組文庫片段大小在400-900bp,符合高通量測序要求涂屁；中值基因3427個，中值UMI 13323個灰伟，測序質(zhì)量良好拆又。

圖5小鼠黑色素瘤PDX模型的單細胞建庫實驗質(zhì)控

以上就是單細胞測序過程中的重點質(zhì)控環(huán)節(jié)。當然栏账，影響測序成功的因素還有很多帖族，大家在做實驗的過程中能夠按照操作規(guī)范進行，也可以多積累屬于自己實驗的實驗小技巧~