在整個(gè)PCR體系中码倦，引物占有十分重要的地位企孩。PCR的特異性要求引物與靶DNA特異結(jié)合，不與其他非目的的DNA結(jié)合袁稽，PCR的靈敏性要求DNA聚合酶能與引物進(jìn)行有效的延伸勿璃，可見引物設(shè)計(jì)好壞與PCR結(jié)果密切相關(guān)。

一推汽、PCR引物設(shè)計(jì)原則

1补疑、引物長度一般在15-30bp

引物長度一般為15-30bp，常用的為18-27bp歹撒，但不應(yīng)大于38bp莲组，因?yàn)檫^長會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)暖夭；

2锹杈、引物GC含量一般為40%-60%

引物GC含量一般為40%-60%，以45-55%為宜迈着，GC含量過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)竭望。上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；

3裕菠、引物所對(duì)應(yīng)的模板序列的Tm值最好在72℃左右

Tm值在72℃左右可使復(fù)性條件最佳市框，至少要在55-80℃之間。Tm值的計(jì)算有多種方法糕韧，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)枫振，在Oligo軟件中使用的是最鄰近法(the nearest neighbor method)；

4萤彩、引物3’端的堿基一般不用A

引物3’端的堿基一般不用A粪滤，因?yàn)锳在錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)的引發(fā)效率相對(duì)比較高。

5雀扶、引物3’端出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基杖小，如GGG或CCC肆汹，也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加。

6予权、引物3’端的互補(bǔ)昂勉、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。

7扫腺、如擴(kuò)增編碼區(qū)域岗照，引物3’端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第三位易發(fā)生簡并笆环，會(huì)影響擴(kuò)增特異性與效率攒至；

8、引物5’端可以修飾

引物5’端序列對(duì)PCR影響不太大躁劣，因此常用來引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物迫吐。

9、堿基要隨機(jī)分布账忘，且引物自身和引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)志膀。

引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列鳖擒，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)溉浙。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的败去，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在放航。引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin）使引物本身復(fù)性圆裕。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合广鳍。引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。兩引物之間也不應(yīng)具有互補(bǔ)性吓妆，尤其應(yīng)避免3’端的互補(bǔ)重疊以防止引物二聚體（Dimer與Cross Dimer）的形成赊时。引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可避免的話行拢，應(yīng)盡量使其△G值不要過高（應(yīng)小于4.5kcal/mol）祖秒。否則易導(dǎo)致引物二聚體帶的 產(chǎn)生，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行舟奠。

10竭缝、引物的ΔG值最好呈正弦曲線形狀，即3’端ΔG值較低沼瘫，而5’端和中間ΔG值相對(duì)較高抬纸。

ΔG值（自由能）反應(yīng)了引物與模板結(jié)合的強(qiáng)弱程度，一般情況下耿戚，引物的ΔG值最好呈正弦曲線形狀湿故，即3’端ΔG值較低阿趁，而5’端和中間ΔG值相對(duì)較高。3'端的ΔG值相對(duì)要低坛猪，且絕對(duì)值不要超過9脖阵，引物的3’端的ΔG值過高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)墅茉。

11命黔、引物應(yīng)在核酸保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個(gè)互補(bǔ)堿基同源躁锁。

二纷铣、Real Time PCR引物設(shè)計(jì)原則

Real Time PCR用引物與普通PCR引物設(shè)計(jì)要求不同卵史。RealTime PCR是讓目的基因按照理論值進(jìn)行擴(kuò)增战转，對(duì)非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求嚴(yán)格。

三以躯、常用的引物設(shè)計(jì)軟件

“Primer premier”槐秧，“Oligo”，“Vector NTI Suit”忧设，“DNAsis”刁标，“Omiga”和“DNAstar”。

插播：后臺(tái)回復(fù)【引物設(shè)計(jì)軟件】即可Oligo/DNAstar/Primer premier5/6/DNAstar軟件址晕。

下面詳細(xì)介紹一下Primer premier 5.0的用法：

1膀懈、通過File下的New或Open載入需要設(shè)計(jì)引物的序列

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2、進(jìn)入到程序的引物設(shè)計(jì)窗口

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3谨垃、點(diǎn)擊search启搂，則出現(xiàn)新的界面

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在新界面設(shè)置你需要設(shè)計(jì)的引物的相關(guān)參數(shù)。主要有五個(gè)要設(shè)置的地方刘陶。

第一個(gè)地方是選擇設(shè)計(jì)PCR引物胳赌，測序引物和雜交探針，如果要做PCR就選第一個(gè)圈圈“PCR Primers”匙隔。

第二個(gè)地方是搜尋模式疑苫，一般我們搜索引物是以對(duì)搜索，所以一般選"pairs"纷责。

第三個(gè)地方是正負(fù)鏈的所在區(qū)間以及產(chǎn)物的大小長度捍掺，這個(gè)按自己的需要來，跟實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠嘘P(guān)再膳，具體情況具體分析挺勿。第四個(gè)地方是引物的長度以及正負(fù)波動(dòng)值，一般來說引物長度在18-27范圍內(nèi)饵史。第五個(gè)地方是選擇模式满钟，一般選“Automatic”胜榔。設(shè)置完上面所說的這些地方后按“OK”鍵，則跳轉(zhuǎn)到新界面湃番。

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4夭织、點(diǎn)擊“OK”，出現(xiàn)如下新界面

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顯示結(jié)果按照評(píng)估分?jǐn)?shù)從高到低向下排列吠撮， 一般選取評(píng)估分?jǐn)?shù)較高的結(jié)果尊惰。打分是衡量引物質(zhì)量的綜合性參數(shù)，利用打分系統(tǒng)可以對(duì)引物進(jìn)行有效評(píng)估和引物間進(jìn)行對(duì)比選擇提供有效的證據(jù)泥兰。如果我們只想要尋找正向或反向的引物弄屡，就可以選擇“Sense”或“Anti-sense”按鈕。

5鞋诗、點(diǎn)擊評(píng)分高的結(jié)果膀捷，就可以顯示引物的詳細(xì)信息，如下圖削彬。

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該圖左上角的兩個(gè)按鈕

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和

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分別代表的是正向和反向引物全庸。該圖中間部分給出了引物的得分，位置融痛，長度壶笼，Tm值，GC含量雁刷，自由能等信息覆劈。該圖最下面的模塊給出了正反引物是否形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，二聚體沛励，錯(cuò)配以及引物之間的二聚體等情況责语，紅色代表有。點(diǎn)擊

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或

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我們會(huì)看到出現(xiàn)這些結(jié)構(gòu)的具體信息侯勉，比如開始的位置鹦筹，產(chǎn)生的自由能。

6址貌、如果我們對(duì)搜索到的引物不滿意铐拐，可以手動(dòng)調(diào)整引物的位置，同時(shí)可以點(diǎn)擊

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的按鈕對(duì)引物進(jìn)行修改练对。如下圖遍蟋，我們可以增加，刪除或修改堿基螟凭。直到找到最佳的結(jié)果虚青。

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7、最后將設(shè)計(jì)好的引物導(dǎo)出或復(fù)制出來螺男。

四棒厘、推薦幾款在線引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站

1纵穿、Primer3

http://bioinfo.ut.ee/primer3/

一個(gè)廣泛使用的PCR引物設(shè)計(jì)程序。

2奢人、Primer-BLAST

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

在線設(shè)計(jì)用于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的特異性寡核苷酸引物,這個(gè)工具同時(shí)整合了Primer3和NCBI的Blast功能谓媒。

3、GeneFisher

http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher2/

提供一個(gè)在線的簡并引物設(shè)計(jì)工具何乎，基礎(chǔ)是同源基因句惯。

4、Primer3Plus

http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi

5支救、BiSearch

http://bisearch.enzim.hu/?m=genompsearch

特別推薦設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增高度冗余的亞硫酸氫鹽處理的序列的引物抢野。提供快速的ePCR方法避免非特異性PCR產(chǎn)物。

6各墨、Web Primer

https://www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer

斯坦福大學(xué)提供的在線引物設(shè)計(jì)軟件,酵母基因組數(shù)據(jù)庫提供指孤。

7、AutoPrime

http://www.autoprime.de/AutoPrimeWeb

快速設(shè)計(jì)真核表達(dá)實(shí)時(shí)定量PCR引物在線軟件欲主。

下面就Primer-BLAST的用法做一下介紹

進(jìn)入NCBI的Primer-BLAST——

1邓厕、Primer-BLAST的輸入

Primer-BLAST界面包括了Primer3和BLAST的功能逝嚎。提交的界面主要包括三個(gè)部分：target template（模板區(qū)）, the primers（引物區(qū)）, 和specificity check（特異性驗(yàn)證區(qū)）扁瓢。

如下圖，在“PCR Template”下方左側(cè)的文本框中輸入FASTA格式的序列或Accession Number补君，或點(diǎn)擊“選擇文件”載入FASTA格式的文件引几。右側(cè)可以設(shè)置正向引物和反向引物的起始和終止位置。在“Primer Parameters”模塊挽铁，可以輸入PCR產(chǎn)物的大小和Tm值參數(shù)伟桅。如何你已經(jīng)設(shè)計(jì)好了引物，要拿來驗(yàn)證引物的好壞叽掘，可以在此輸入楣铁。

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2、驗(yàn)證引物的特異性

在“Primer Pair Specificity Checking Parameters”區(qū)更扁，選擇設(shè)計(jì)引物或驗(yàn)證引物時(shí)的目標(biāo)數(shù)據(jù)庫和物種盖腕。這一步是比較重要的。這里提供了7種數(shù)據(jù)庫：

RefSeq mRNA, Refseq representativegenomes浓镜，nr溃列，RefseqRNA(refseq_rna)，Genome (reference assembly fromselected organisms), Custom, and Genome(chromosomes from all organisms)膛薛。推薦使用“Refseq representative genomes”數(shù)據(jù)庫听隐；Genomedatabase (chromosomes from all organisms)是NCBI染色體數(shù)據(jù)庫的舊版本，不再推薦使用哄啄；Custom可以使用自己的序列作為搜索數(shù)據(jù)庫雅任。當(dāng)你用NCBI的參考序列作為模板和參考序列數(shù)據(jù)庫风范。

作為標(biāo)準(zhǔn)來設(shè)計(jì)引物時(shí)，Primer-BLAST可以設(shè)計(jì)出只擴(kuò)增某一特定剪接變異體基因的特異引物沪么。跟其它的BLAST一樣乌企，點(diǎn)擊底部的“Advanced parameters”有更多的參數(shù)設(shè)置。

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3成玫、結(jié)果界面

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上圖是引物的可視化結(jié)果加酵，該結(jié)果會(huì)顯示出所有引物的起始和終止位置，基因的CDS區(qū)哭当，外顯子的位置等猪腕。

其次，Primer-BLAST還會(huì)給出每一個(gè)引物對(duì)的具體信息钦勘，如下圖陋葡。包括引物序列，長度彻采，起始終止位置腐缤，Tm值，GC含量肛响，自身互補(bǔ)和3’端互補(bǔ)情況岭粤，PCR產(chǎn)物的長度和位置等。其中特笋，Self complementarity和Self 3' complementarity的值越小越好剃浇。

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參考：https://zhuanlan.zhihu.com/p/50089556