????分享一篇多肽信號在胚胎與胚乳之間移動，調(diào)控胚胎角質(zhì)層發(fā)育的文章领舰。
摘要概述
????在胚胎發(fā)育早期夫嗓，胚胎中產(chǎn)生TWISTED SEED1(TWS1)小肽的前體，通過初生不連續(xù)角質(zhì)層的空隙冲秽，擴(kuò)散到胚乳中舍咖，由胚乳特異表達(dá)的ABNORMAL LEAF SHAPE1(ALE1)酶加工成活性肽，回到胚胎中锉桑，與胚胎特異表達(dá)的受體激酶GASSHO1/2(GSO1/2)識別排霉，調(diào)控形成完整的胚胎角質(zhì)層。
背景補(bǔ)充
????植物的角質(zhì)層（The plant cuticle）是由疏水的脂質(zhì)和蠟質(zhì)分泌到表皮細(xì)胞的細(xì)胞壁外側(cè)后形成的民轴。
????在擬南芥胚胎發(fā)育的早期攻柠，胚胎角質(zhì)層是初生不連續(xù)的，到心形胚時期后裸，胚胎表皮細(xì)胞外側(cè)形成完整的角質(zhì)層瑰钮，將胚胎細(xì)胞與周圍的胚乳細(xì)胞等隔開。
???GASSHO1 (GSO1) 和GSO2 受體激酶在胚胎中表達(dá)微驶，影響在胚胎發(fā)育過程中影響角質(zhì)層的功能浪谴。gso1 gso2 雙突變體表型：對親水性燃料的透性增強(qiáng)，50-80%的子葉融合。
????轉(zhuǎn)錄因子ZHOUPI (ZOU) 和ABNORMAL LEAF SHAPE1 (ALE1)是兩個胚乳特異的轉(zhuǎn)錄因子（endosperm specific proteins）苟耻。有研究表明 GSO1篇恒、GSO2與ZOU、ALE1在同一條通路上調(diào)控胚胎發(fā)育梁呈。
????枯草桿菌蛋白酶（subtilase）在胚乳中表達(dá)，能夠?qū)﹄那绑w進(jìn)行加工蘸秘，TWS1 前體和GASSHO 受體在胚胎中表達(dá)官卡。TWS1在2016年被報道與角質(zhì)層的沉積有關(guān)。
一醋虏、TWS1可能與GSO共同調(diào)控胚胎角質(zhì)層發(fā)育
????被子植物的種子可以劃分為三個區(qū)間：合子胚寻咒、胚乳、種皮颈嚼。
CASPARIAN STRIP INTEGRITY FACTORs (CIFs)是一種酪氨酸硫酸化多肽【個人注：酪氨酸硫酸化多肽需要進(jìn)行翻譯后修飾毛秘，該類多肽有：PSK\PSY\RGF，通過酪氨酸硫酸化轉(zhuǎn)移酶TPST進(jìn)行催化】阻课，CIF1/2作為GSO1/2的配體叫挟，調(diào)控根內(nèi)皮層中凱氏帶的形成。那CIFs是否調(diào)控胚胎角質(zhì)層的發(fā)育呢限煞。作者沿著這條思路，構(gòu)建遺傳材料cif1 cif2 cif3 cif4，并未觀察到種子扭曲依啰、高滲表型表型(fig. S1A)耕餐。
????但是在TPST的敲低sgn2-1和敲除tpst-1突變體中，觀察到與ale1相似的種子扭曲旺上、高滲表型表型瓶蚂。這暗示著，存在某種硫酸化多肽調(diào)控種子的發(fā)育宣吱，雖然該肽不是CIFs窃这。【注：TPST作為一種酪氨酸硫酸化酶征候，其突變影響種子發(fā)育钦听，也就說明很可能是該酶壞掉后，該酶催化的某種多肽也壞掉了倍奢，導(dǎo)致影響種子發(fā)育朴上。】
???? 到此已知卒煞，TPST單突有表型痪宰，GSO1/2有表型且明確知道調(diào)控胚胎角質(zhì)層。那么TPST是否與GSO1/2在一條信號通路上干活呢？
????借助遺傳材料衣撬，tpst-1 gso1-1 gso2-1和gso1-1 gso2-1表型一致乖订，說明三者在一條通路上【吡罚【在gso1-1 gso2-1雙突的基礎(chǔ)上乍构，敲除TPST，如果不在一條通路扛点，應(yīng)該是出現(xiàn)表型更加嚴(yán)重哥遮，或者表型不一致】。
????tpst-1 ale1-4這兩類翻譯后修飾酶陵究，的雙突眠饮，與gso1-1 gso2-1表型也相似，于是作者認(rèn)為TPST與ALE是兩條平行的調(diào)控通路铜邮∫钦伲【這里沒看懂是啥意思，個人理解是：根據(jù)tpst-1 ale1-4雙突表型都比各自的單突表型嚴(yán)重松蒜，所以二者是在兩條通路上扔茅，加之考慮到二者是兩種不同的加工酶，所以就更加坐實是在兩條通路上秸苗？】
????在2016年報道了TWS1調(diào)控胚胎角質(zhì)層咖摹，這里作者重新敲除得到了tws1的突變體，與 gso1-1 gso2-1種子扭曲难述、高滲表型一致萤晴，且不存在加性，說明TWS1與GSO1/2在同一條通路上胁后。
????并且在tws1中胚胎角質(zhì)層的發(fā)育也同樣受損店读，更進(jìn)一步暗示TWS1可能與GSO1/2共同調(diào)控胚胎角質(zhì)層的發(fā)育∨市荆【可從上述表型屯断，以及已有的報道中推測，因為GSO1/2的配體是與TWS1同屬于硫酸化的肽】
小結(jié)一
????【至此侣诺，本文通過TPST酶的突變表型殖演，推測受該酶加工的某種肽調(diào)控該表型，于是首先猜到CIFs年鸳，但是四突沒表型趴久，于是猜測其他的，結(jié)合TWS1多肽的報道搔确，重新敲除后確定TWS1表型彼棍。文章做到這里灭忠，一般的思路是往下驗證TWS1與GSO1/2互作，共同調(diào)控表型座硕，結(jié)束弛作，比較常規(guī)，且同類家族的多肽CIFs與GSO1/2作為配體受體已經(jīng)被報道過华匾，新意有待提升映琳。】
????那么作者是如何往下進(jìn)行思考的呢蜘拉？
2萨西、ALE1的加工對于TWS1與GSO的互作是必要的
????【前文提到的ale1表型，以及領(lǐng)域內(nèi)的背景知識：ALE1與GSO1/2在同一條通路上調(diào)控胚胎角質(zhì)層的發(fā)育诸尽，并且ALE1蛋白酶是在胚乳中特異表達(dá)原杂，那如果能夠闡明ALE1的加工對于TWS1的活性是必須的印颤，那就與這幾個基因的表達(dá)部位的特異性您机，以及細(xì)胞分區(qū)，精確調(diào)控相關(guān)年局，就很有意思了际看。】
????接下來證明TWS1能夠被ALE1加工矢否，在煙草體內(nèi)仲闽，和體外純化中證明TWS1被ALE1加工切割，并進(jìn)一步細(xì)化到切割位點(diǎn)位于His54 和 Gly55僵朗。將TWS1的這兩個氨基酸突變后赖欣，TWS1將不能被ALE1切割，說明這兩個氨基酸殘基對于TWS1的剪切位點(diǎn)非常關(guān)鍵验庙。并且依賴于ALE1的加工發(fā)生在TWS1的C端顶吮。【后面的幾句沒太懂粪薛，個人理解是悴了，TWS1和CIFs的氨基酸序列比較來看，由于CIFs位置更靠C端违寿，TWS1沒那么靠近C端湃交，所以TWS1的C端需要ALE1進(jìn)行加工來激活TWS1的活性√俪玻】這或許可以解釋同類硫酸化多肽在種子和根中發(fā)揮不同功能搞莺。
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????【既然C端ALE1的加工對于TWS1的活性是不可少的，那么N端的DY基序是否也如此呢掂咒？】
????于是接下來檢測TWS1的生物活性腮敌，但是由于合成的肽對于胚胎的處理是困難的阱当，于是作者用的是在根中的CIFs的研究系統(tǒng)。在根中糜工，CIFs能夠引起異位的內(nèi)胚層的木質(zhì)化弊添，且該過程依賴于GSO，實驗發(fā)現(xiàn)TWS1同樣具有此功能捌木。于是通過在cif1/2雙突中分別施加硫酸化后的肽油坝、未硫酸化的肽來看硫酸化對于TWS1生物活性的影響，結(jié)果：硫酸化TWS1能夠在一定程度上恢復(fù)cif1/2造成的gaps刨裆，而未硫酸化的TWS1不能澈圈。
????這表明N端的硫酸化對于TWS1的生物活性不可或缺。進(jìn)一步將發(fā)生硫酸化的氨基酸殘疾Y33突變帆啃，也同樣展示出了與硫酸化多肽酶TPST的突變體tpst相似的表型瞬女。這更全面的說明了，TWS1的N端DY基序上由TPST酶所執(zhí)行的硫酸化修飾對于TWS1的生物活性不可或缺努潘。
????并且在上述中诽偷，借助根的體系還暗含了在根中TWS1對于內(nèi)皮層的影響是依賴于GSO1/2的。
????那么接下來終于要做互作實驗了【對于小肽配體與受體之間的互作疯坤，一般會通過ITC\MST\GCI报慕，能夠更高靈敏度的檢測互作】。
????Grating-coupled interferometry (GCI）光柵耦合干涉技術(shù)能夠基于光波信號傳導(dǎo)來提供分子間互作的動力學(xué)數(shù)據(jù)压怠，確定親和力常數(shù)等眠冈。實驗中，顯示TWS1與GSO1互作菌瘫，Kd解離常數(shù)在30nM蜗顽，確實比CIFs與GSO1的互作弱，這也剛好能夠與體外施加恢復(fù)的程度（TWS1恢復(fù)效果不如CIF）對應(yīng)的上雨让。
????并且進(jìn)一步做了未硫酸化的TWS1與GSO的雇盖，進(jìn)一步證實了TWS1的硫酸化對于二者互作是關(guān)鍵的。此外宫患，將TWS1的C端添加3AAA【用來阻擋ALE1的切割刊懈？】，結(jié)果證明添加3AAA之后娃闲，互作變?nèi)跣檠矗脕碜C明C端的ALE1的加工是重要的。
小結(jié)二
????通過以上三類實驗皇帮，證明了：
????????1卷哩、TWS1被ALE1加工
????????2、TWS1與GSO互作
????????3属拾、N端硫酸化至關(guān)重要
????????4将谊、C端ALE1切割至關(guān)重要
三冷溶、TWS1在胚胎與胚乳之間穿梭
???? tpst 純合突變體用野生型花粉進(jìn)行授粉后，沒有胚胎表型尊浓，在F1代中只有tpst x tpst展示出表型逞频，說明該表型是 合子起源【？】栋齿。
????TPST在種子中遍在表達(dá)苗胀，為了探索哪一個區(qū)室的TPST對TWS1產(chǎn)生影響，于是分別用遍在啟動子 RPS5A瓦堵、胚胎特異啟動子 PIN1基协、胚乳特異啟動子RGP3驅(qū)動TPST的表達(dá)。結(jié)果： RPS5A菇用、 PIN1下均能回補(bǔ)澜驮，只有RGP3驅(qū)動下，不能回補(bǔ)惋鸥，這暗示TPST對TWS1的加工在胚胎中發(fā)生杂穷。
????并且TWS1的定位分析顯示:TWS1在胚胎初期開始在整個胚胎區(qū)域表達(dá)，隨后揩慕，被限制在root tip【表達(dá)pattern同樣暗示了：這種前后期表達(dá)的差異非常重要】亭畜。
???? 【那么TWS1作為信號肽在胚胎中產(chǎn)生扮休，在胚胎中用TPST進(jìn)行N端硫酸化加工迎卤，為什么還需要跑到胚乳中用ALE1進(jìn)行C端加工，然后再跑回胚胎中與受體GSO結(jié)合玷坠，調(diào)控胚胎角質(zhì)層完整性的沉積蜗搔？這樣穿梭的意義，或者需要在特定細(xì)胞分區(qū)之間加工的意義是什么呢八堡？】
???? 作者在tws1背景下轉(zhuǎn)入pTWS1:ALE1樟凄，得到胚胎特異表達(dá)的ALE1，然后通過雜交引入TWS1兄渺，這樣得到均在胚胎中表達(dá)的TWS1缝龄、ALE1以及GSO【為什么要在tws1背景下】。該類種子成熟時嚴(yán)重枯萎挂谍，但仍有部分可以發(fā)芽叔壤，說明胚胎中所有信號持續(xù)共表達(dá)會對種子發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響，胚胎信號的持續(xù)激活口叙，引起種子的應(yīng)激基因上調(diào)炼绘。這就為上一個問題提出了解釋：空間的分區(qū)或許提供了胚胎信號衰減的條件。
???? 接下來妄田，用胚乳特異啟動子RGP3分別驅(qū)動CIF1俺亮、CIF2驮捍、TWS1去回補(bǔ)tws1和ale1的表型，發(fā)現(xiàn)均能回補(bǔ)tws1表型脚曾，這說明在胚乳空間中進(jìn)行加工东且，再返回胚中的肽，對胚胎角質(zhì)層完整性的沉積是關(guān)鍵的【胚乳一輪游之后的肽本讥，是有功能的肽】苇倡。對ale1的回補(bǔ)，缺失C端的CIF具有更強(qiáng)的回補(bǔ)效果【缺失了C端意味著該實驗中CIF不用通過ALE1等酶的加工囤踩，相比于ale1背景下ALE1缺失旨椒，無法對TWS1進(jìn)行加工來看，TWS1如果完全恢復(fù)ale1的表型堵漱，說明ALE1是TWS1唯一的加工酶综慎，如果如文章中不能完全恢復(fù)，那么還有別的酶】勤庐。
小結(jié)三
???? 以上兩部分說明了：TWS1信號若在從產(chǎn)生到加工一直在胚胎中示惊，即胚胎信號在胚胎中持續(xù)共表達(dá)，會引起種子應(yīng)激愉镰，對種子發(fā)育有害米罚。在胚乳中進(jìn)行的加工，具有對胚胎發(fā)育/角質(zhì)層沉積的調(diào)節(jié)作用丈探。
Model
???? 綜上录择，作者提出，TWS1在胚胎產(chǎn)生碗降，胚乳加工隘竭，再返回胚胎發(fā)揮功能，這樣的雙向信號傳導(dǎo)模式能夠有效地監(jiān)察胚胎角質(zhì)層的完整性讼渊。具體為：
胚胎產(chǎn)生TWS1前體动看，經(jīng)由N端硫酸化加工后，分泌到胚胎外爪幻，通過不連續(xù)的角質(zhì)層的空隙菱皆，擴(kuò)散到胚乳中
在胚乳中被ALE1等酶進(jìn)行C端加工，使其具有活性
活性TWS1再次經(jīng)由角質(zhì)層空隙回到胚胎中挨稿，與胚胎中的受體GSO1/2結(jié)合仇轻，激活下游信號通路，對角質(zhì)層進(jìn)行修復(fù)
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直到角質(zhì)層沉積完整叶组，肽前體被限制在胚胎中拯田，該信號逐漸衰減
模式圖.png
個人總結(jié)與收獲
- GCI實驗嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶φ赵O(shè)計，小肽互作實驗真的是在精不在多甩十，全文的互作只有GCI船庇，但GCI的各種對照結(jié)果都是很好的吭产。相信也下功夫摸索了實驗體系。
- 如何證明肽的移動鸭轮，感覺本文對于移動的證明非常巧妙臣淤，是通過小肽發(fā)揮功能的兩個關(guān)鍵環(huán)節(jié)下手證明，一個是小肽具有功能所必需的前體加工窃爷，二是小肽發(fā)揮功能所必需的受體邑蒋。通過加工酶與受體的細(xì)胞區(qū)間定位的差異，來講述“移動”按厘。
- 一開始在cifs沒有表型之后医吊，仍然找到新的思路并做出很好的文章。
參考文獻(xiàn)
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3.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5100777/
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通訊lab
http://www.ens-lyon.fr/RDP/squelette/personnel-du-rdp/?lang=fr
