三十六策 第 11 策 見微知著
miRNA 研究的優(yōu)勢
第一益楼，miRNA 是非編碼 RNA谬运，沒有蛋白 表達(dá)差異拭卿、驗證基因過表達(dá)還是沉默的效率，只需要 qPCR 驗證
第二幢竹，miRNA 是短片段，直接合成就行饵溅，轉(zhuǎn)染效率高妨退，不需要用病毒載體
第三，探索分子機(jī)制蜕企，miRNA 有一套固定的機(jī)制模式：miRNA一般作用于靶基因的 3’-UTR 引起下游靶基因表達(dá)沉默 熒光素酶報告基因?qū)嶒?/p>
已知 miRNA 預(yù)測它的靶基因→有現(xiàn)成的數(shù)據(jù)庫
miRNA 的規(guī)范化套路
miRNA 第一個特征是長度整齊劃一咬荷，都是 19-25 核苷酸的單鏈 RNA 片段，在物種之間保守性比較好轻掩，突變的概率小幸乒。
成熟的miRNA分子可以跟一個或多個mRNA分子不完全匹配的互補(bǔ)結(jié)合，一旦結(jié)合上就可以下調(diào)基因的表達(dá)唇牧。miRNA主要作用位點(diǎn)在靶基因的3’-UTR罕扎，依賴于RISC沉默復(fù)合體發(fā)揮作用
查詢 miRNA 的權(quán)威數(shù)據(jù)庫是 miRBase
現(xiàn)在的 miRNA 命名，起頭先用物種名稱丐重，如人的是 hsa腔召，小鼠是 Mmu，大鼠是 Rno 扮惦，物種后面加一個橫杠接 miRNA 簡寫成 miR/mir臀蛛，再加個橫杠接序號數(shù)字。
如果遇到新發(fā)現(xiàn)的 miRNA 跟已有名稱的高度同源的情況崖蜜，序列只差 1-2 個堿基浊仆，區(qū)分開來沒法體現(xiàn)這種序列和功能上的相似性，那就在第一個發(fā)現(xiàn)的 miRNA 后加上小寫的 a/b/c 這樣區(qū)分豫领。
如果一條 miRNA 可以來源于不同的 DNA 編碼區(qū)域抡柿，也就是在基因組有平行的多個拷貝，那么還要在 a/b/c 后面加個橫杠再以數(shù)字 1/2/3 來表示等恐。
物種-miR-數(shù)字序號+字母-5p/3p
功能基因 5 步法研究套路:
1)檢測基礎(chǔ)表達(dá)水平;2)制備分子操作工具;3)細(xì)胞功能表型實驗;4)動物水平表型驗證;5)Rescue 實驗洲劣。
先篩备蚓、猜分子，在五步法里完成前面三步就已經(jīng)得到了細(xì)胞水平的表型結(jié)果囱稽，過表達(dá)加沉默一正一反的雙向研究星著， 在找候選分子的時候只要先做一個方向就行了，在疾病中高表達(dá)的分子做沉默驗證粗悯，低表達(dá)的分子做過表達(dá)虚循，目標(biāo)是抑制或者緩解致病的表型。
套路執(zhí)行的第一步還是分析 miRNA的表達(dá)差異情況样傍，包括細(xì)胞和組織水平的檢測横缔。
蛋白可以做免疫組化、免疫熒光衫哥，miRNA 只需要做 RNA 水平用實時定量 PCR(Real-time PCR)來驗證就行了茎刚。
第二步是制備 miRNA 過表達(dá)或者抑制的實驗工具，這一步基本等同于做 RNA 干擾時候合成 siRNA 片段撤逢。
miRNA 過表達(dá)有個專用名詞叫 mimics(模擬物)
miRNA 的沉默叫 inhibitor(抑制物)
用定量 PCR 來檢測一下膛锭，這一步也不需要 Western
第三步細(xì)胞表型驗證，同樣研究一個表型蚊荣，模型一樣初狰、Assay 一樣、Biomarker 一樣往里套就好了互例。
找 miRNA 的靶基因
機(jī)制(Mechanism)
解釋一個分子介導(dǎo)某種表型背后的原因就是分子機(jī)制
變量分子和通路組合在一起奢入，通路就是解釋分子發(fā)揮功能的機(jī)制
藥物和分子組合在一起，分子就是解釋藥物為什么有效的機(jī)制
藥物也可以跟通路串聯(lián)在一起媳叨，用通路變化來解釋藥物起效的機(jī)制
機(jī)制研究的兩個層次：知其然不知其所以然 和 知其然知其所以然腥光。
知其然不知其所以然是間接作用機(jī)制，是分子機(jī)制的初級層次糊秆，知道了主變量通過影響下游另外一個因變量發(fā)揮功能武福，但是他們之間具體怎么調(diào)節(jié)的，不清楚痘番，僅僅解答了 Why 的問題捉片。
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知其然知其所以然是直接作用機(jī)制，是分子機(jī)制的高級層次夫偶，不但知道有調(diào)控關(guān)系界睁，而且知道直接作用的靶點(diǎn)和方式是什么觉增。在 Why 的問題基礎(chǔ)上兵拢，How 的問題也有了解釋。
miRNA 靶向作用于下游一個編碼基因逾礁，是最簡單的一種機(jī)制模型
miRNA 為主變量的研究項目只要有分子機(jī)制一般就是做靶基因说铃，這是一種直接作用機(jī)制
在預(yù)測 miRNA 靶基因方面最權(quán)威的數(shù)據(jù)庫是 Targetscan
實驗驗證是不是潛在靶基因访惜，只需要在細(xì)胞株中過表達(dá) miRNA 然后 qPCR，WB 檢測一下腻扇，選出 miRNA 過表達(dá)以后表達(dá)下調(diào)的預(yù)測靶點(diǎn)债热。找到這種有顯著負(fù)調(diào)節(jié)關(guān)系的預(yù)測靶基因后再加一個 Luciferase assay，就可以證明直接調(diào)控作用了幼苛。
熒光素酶報告基因?qū)嶒灒河迷?miRNA 靶基因驗證窒篱；在研究轉(zhuǎn)錄因子對啟動子的調(diào)控活性
阻遏翻譯和引導(dǎo) mRNA 降解是兩種機(jī)制，一個 miRNA 過表達(dá)舶沿，其靶基因 mRNA 可能表達(dá)降低墙杯，也可能變化不顯著，但在蛋白水平應(yīng) 該表現(xiàn)為明顯的降低括荡，
總結(jié)
功能基因研究五步法基礎(chǔ)上高镐，往里換一個miRNA分子，整體數(shù)據(jù)框架是一致的畸冲。前面四步miRNA的套路跟功能基因一樣嫉髓，只是操作細(xì)節(jié)略有區(qū)別，總體而言miRNA實驗比蛋白更好做邑闲。第五步Rescue跟前面套路不太一樣算行，單變量的Rescue，只適合功能基因苫耸，不太適合非編碼RNA纱意。而且我們已經(jīng)提出了miRNA的靶基因驗證，那么Rescue也不再是單變量的Rescue了鲸阔，而是上下游具有調(diào)控關(guān)系的分子間的rescue驗證策略偷霉。
