轉(zhuǎn)錄組學(xué)和甲基組學(xué)分析為水稻雜種優(yōu)勢(shì)的分子機(jī)制和預(yù)測(cè)提供了新的思路

Summary

? 雜種優(yōu)勢(shì)已在多種作物上得到廣泛應(yīng)用炸庞。 然而媒役，雜種優(yōu)勢(shì)的分子機(jī)制和預(yù)測(cè)仍不清楚偿曙。 我們獲得了5個(gè)F1組合龙亲，其中4個(gè)表現(xiàn)出超親優(yōu)勢(shì)1表現(xiàn)出中親優(yōu)勢(shì)，并進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)和甲基組學(xué)分析恳不，以鑒定雜種優(yōu)勢(shì)的候選基因檩小，探索雜種優(yōu)勢(shì)的分子機(jī)制和潛在的預(yù)測(cè)因子。 轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明烟勋，4個(gè)優(yōu)良親本所共有的差異表達(dá)基因在分子功能方面得到了顯著的富集规求，加性和顯性效應(yīng)對(duì)雜種優(yōu)勢(shì)的發(fā)生起著至關(guān)重要的作用。 DNA甲基化水平神妹，特別是在CG背景下，與單株籽粒產(chǎn)量顯著正相關(guān)家妆。 親本間CG背景下的差異甲基化區(qū)域與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的比值與其雜種的雜種優(yōu)勢(shì)水平呈顯著負(fù)相關(guān)鸵荠，這一點(diǎn)在其他水稻品系的24對(duì)比較中得到了進(jìn)一步證實(shí)，表明該比值可以作為預(yù)測(cè)雜種優(yōu)勢(shì)水平的一個(gè)可行指標(biāo)伤极，而生育早期親本間該比值小于5可能是判斷其F1雜種發(fā)生雜種優(yōu)勢(shì)的一個(gè)重要指標(biāo)蛹找。 此外，我們還發(fā)現(xiàn)了一些重要的差異表達(dá)和甲基化基因哨坪，如OsDCL2庸疾、PI5、DTH2当编、DTH8届慈、HD1和GLW7，它們?cè)?個(gè)較好的親本雜種中表現(xiàn)出差異表達(dá)和甲基化，可作為BPH的候選基因金顿。 我們的發(fā)現(xiàn)有助于進(jìn)一步闡明分子機(jī)制和雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)臊泌。

Introduction

? 雜種優(yōu)勢(shì)是指雜種一代在生物量、產(chǎn)量揍拆、生長(zhǎng)速度和抗逆性等方面優(yōu)于親本的現(xiàn)象渠概。 自19世紀(jì)初達(dá)爾文首次發(fā)現(xiàn)以來，雜交育種已廣泛應(yīng)用于多種作物的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中嫂拴，如玉米播揪、水稻、高粱筒狠、油菜和番茄等猪狈。 （Gai等人 , 2016) 自20世紀(jì)70年代以來，三系雜交水稻和兩系雜交水稻首先在中國(guó)發(fā)展并得到廣泛應(yīng)用窟蓝，然后傳播到其他東南亞國(guó)家和美國(guó)罪裹，（Cheng等人, 2007)的研究，極大地促進(jìn)了水稻生產(chǎn)运挫。

? 盡管雜種優(yōu)勢(shì)在作物育種和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的成功應(yīng)用已有100多年的歷史状共，但雜種優(yōu)勢(shì)的分子機(jī)制仍然是一個(gè)謎，盡管提出了三個(gè)主要假說：顯性（Davenport谁帕，1908）峡继、超顯性（East，1908）和上位性（Powers匈挖，1944）來解釋雜種優(yōu)勢(shì) 然而碾牌，這些遺傳模型在很大程度上是概念性的，不能充分解釋雜種優(yōu)勢(shì)的分子基礎(chǔ)（Birchler等人 , 2010;He等人 , 2013;米勒等人 , 2015) 有趣的是儡循，幾個(gè)早期的研究使用由珍汕97B和明恢63雜交產(chǎn)生的相同的優(yōu)良水稻雜種群體舶吗，證明了不同的雜種優(yōu)勢(shì)遺傳模式，包括部分顯性和超顯性（Li et al择膝。 誓琼，2008），上位性（Yu et al 肴捉，1997）腹侣，以及超顯性和假超顯性（Zhou et al ，2012）齿穗，表明不同的遺傳模型可能都有助于雜種優(yōu)勢(shì)傲隶。 最近，全基因組關(guān)聯(lián)研究和其他組學(xué)方法已被用于探索雜種優(yōu)勢(shì)的分子基礎(chǔ)（Huang et al窃页。 , 2015;Yang等人 , 2017;Zhen等人 , 2017;朱等人 , 2016) 例如跺株，Huang等人 （2015）發(fā)現(xiàn)复濒，總體雜合度在雜種優(yōu)勢(shì)中不起重要作用，但某些特定位點(diǎn)的雜合度在水稻雜種優(yōu)勢(shì)中起重要作用帖鸦。 最近的研究也提示了小RNA和表觀遺傳調(diào)控在雜種優(yōu)勢(shì)中的作用（Chen芝薇，2013；川邊等人 , 2016;勞斯等人 , 2018;Li等人 , 2014;Shen等人 , 2012;張等人 , 2014;張等人 , 2015) 盡管取得了一些進(jìn)展作儿，但全面闡明雜種優(yōu)勢(shì)的分子機(jī)制仍然是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)洛二。

? 篩選具有商業(yè)價(jià)值的F1雜交種仍然需要大量的人工勞動(dòng)來進(jìn)行測(cè)交試驗(yàn)。為了減少雜交和F1雜種評(píng)價(jià)的工作量攻锰，育種家和遺傳學(xué)家一直在努力尋找預(yù)測(cè)不同親本之間雜種優(yōu)勢(shì)大小的方法晾嘶。 LaBorda等人 （2005）提出根據(jù)分子標(biāo)記評(píng)價(jià)的遺傳多樣性將親本聚類為不同的雜種優(yōu)勢(shì)群，以指導(dǎo)生產(chǎn)雜交種的選育娶吞。 目前垒迂，在玉米、水稻妒蛇、油菜机断、甜瓜和擬南芥（Dafna等作物上，已有研究證明親本間的遺傳距離與其F1雜種優(yōu)勢(shì)水平并不完全相關(guān)绣夺。 , 2021;費(fèi)爾南德斯等人 , 2015;Silva等人 , 2019;Yang等人 , 2017;尤納斯等人 , 2012;Wang等人 , 2015) 近年來吏奸，從不同角度對(duì)雜種優(yōu)勢(shì)的預(yù)測(cè)進(jìn)行了研究，包括脅迫應(yīng)答基因表達(dá)的自然變異陶耍、（奋蔚、Miller等。 烈钞，2015）泊碑，非線性表型變異（Vasseur等人， 毯欣，2019）和代謝組學(xué)途徑（Dan等人 , 2021) 此外馒过，甲基化信息與復(fù)雜的數(shù)量性狀，如株高（pH酗钞，表現(xiàn)出預(yù)測(cè)關(guān)系腹忽。Hu等人 ，2015）與人類長(zhǎng)壽（Horvath&Raj算吩，2018） 然而留凭，這些預(yù)測(cè)關(guān)系大多建立在數(shù)量遺傳學(xué)和回歸分析的基礎(chǔ)上佃扼，尚未建立一種簡(jiǎn)便有效的預(yù)測(cè)雜種優(yōu)勢(shì)水平的方法偎巢。 在以往的研究中，一般只利用1~2個(gè)F1雜種及其親本來研究遺傳機(jī)制兼耀，不能有效地區(qū)分中親優(yōu)勢(shì)和超親優(yōu)勢(shì)压昼。 實(shí)際上求冷，在培育具有商業(yè)價(jià)值的農(nóng)作物和蔬菜雜交品種方面，雜種優(yōu)勢(shì)比MPH更有價(jià)值窍霞。 本研究選用2個(gè)優(yōu)良恢復(fù)系：廣恢998（R998）和廣恢308（R308）匠题，2個(gè)保持系：五豐B（WFB）和榮豐B（RFB），代表我國(guó)南方優(yōu)良雜交稻親本（其雜交組合至2020年底累計(jì)種植面積超過2200萬公頃）配制5個(gè)雜交種但金。 其中4個(gè)雜種表現(xiàn)為雜種優(yōu)勢(shì)韭山，而來自兩個(gè)保持系的一個(gè)雜種表現(xiàn)為雜種優(yōu)勢(shì)。 因此冷溃，我們可以通過研究轉(zhuǎn)錄組和甲基組的變化來揭示水稻雜種優(yōu)勢(shì)發(fā)生的分子機(jī)制钱磅，探索潛在的預(yù)測(cè)因子。

結(jié)果

幾個(gè)產(chǎn)量相關(guān)性狀的雜種優(yōu)勢(shì)評(píng)價(jià)

? 為了便于產(chǎn)量相關(guān)性狀的研究似枕，利用2個(gè)恢復(fù)系R998和R308與2個(gè)保持系WFB和RFB配制了5個(gè)F1雜種：WY998（WFB/R998）盖淡；WY308（WFB/R308）；RY998（RFB/R998）凿歼；RY308（RFB/R308）褪迟；和WR（WFB/RFB） 我們分別評(píng)估了5個(gè)F1雜種的穗數(shù)（PN）、pH答憔、每穗粒數(shù)（GNPP）味赃、千粒重（KGW）和單株籽粒產(chǎn)量（GYPP）的雜種優(yōu)勢(shì)水平（表S1）。 我們觀察到4個(gè)雜種WY998攀唯、WY308洁桌、RY998和RY308表現(xiàn)出較高的pH（0 BPH為6-9%），大GNPP（1 1–24 7%用于BPH）侯嘀，較大的千克重（2 3–7 BPH為1%）和較大GYPP（9 6– 28 雜種優(yōu)勢(shì)的）為7.6%另凌，而5個(gè)雜交組合F1與其親本的PN僅為7.7% ~ 9.7%。 03到8.53因此不適用于評(píng)價(jià)雜種優(yōu)勢(shì)水平 雜種WR在上述4個(gè)性狀上的表現(xiàn)與親本平均值相似戒幔。 總體而言吠谢，對(duì)于pH、GNPP诗茎、KGW和GYPP工坊，4個(gè)有商業(yè)價(jià)值的雜種WY998、WY308敢订、RY998和RY308表現(xiàn)為雜種優(yōu)勢(shì)王污，而由兩個(gè)保持系WFB和RFB衍生的雜種WR僅表現(xiàn)為MPH 因此，了解較好親本雜種和中間親本雜種轉(zhuǎn)錄組和甲基組的差異有助于鑒定雜種優(yōu)勢(shì)的候選基因楚午。

基于轉(zhuǎn)錄組分析的雜種優(yōu)勢(shì)候選基因鑒定

? 我們對(duì)5個(gè)雜交種及其4個(gè)親本的幼葉（移栽后20天）昭齐、幼穗（抽穗前10天）和灌漿穗（開花后15天）進(jìn)行了3次重復(fù)的全球轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 從每個(gè)基因型的文庫中獲得了大約81.3–1.22億個(gè)mRNA-seq讀數(shù)，并且超過85%的讀數(shù)被定位到參考基因組（http：//mbkbase org/r498/矾柜；表S2）阱驾。 三個(gè)重復(fù)之間的mRNA-seq數(shù)據(jù)顯示高度相關(guān)性（R2>0就谜。 869;圖S1）。

? 我們調(diào)查了5個(gè)雜交水稻F1代相對(duì)于其親本的幼苗里覆、幼穗和灌漿穗中的差異表達(dá)基因（DEGs）丧荐，并檢測(cè)到大量的DEGs[錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）<0 05]在三種類型的測(cè)試組織中（表S3） 為了篩選與雜種優(yōu)勢(shì)相關(guān)的潛在DEGs，我們重點(diǎn)研究了僅在4個(gè)較好親本雜交種中重疊的DEGs作為雜種優(yōu)勢(shì)的潛在候選基因喧枷，并在幼苗虹统、幼穗和灌漿穗中分別鑒定出480、631和259個(gè)上調(diào)的DEGs（圖1A–C）和198隧甚、316和99個(gè)下調(diào)的DEG（圖1D–F窟却；表S4）。 我們注意到呻逆，約有40%的重疊上調(diào)基因在F1代幼苗中的雙親之一中不表達(dá)夸赫，表明顯性效應(yīng)可能在早期生長(zhǎng)階段的雜種優(yōu)勢(shì)中起重要作用。 令人驚訝的是咖城，基因本體論（GO）富集分析表明茬腿，大多數(shù)重疊的DEG僅被歸類為分子功能（FDR<0 05）在三種類型的測(cè)試組織中（圖2A–C），只有少數(shù)上調(diào)的DEG顯著地聚集在與代謝過程宜雀、磷酸化和氨基酸生物合成相關(guān)的生物過程中（圖2A切平，B） 然而，一些先前報(bào)道的稻瘟病抗性位點(diǎn)辐董，包括OsDCL2（Zhang et al悴品。 ，2015）简烘，PI33（Berruyer等人 苔严，2003），PID2（Chen等人 孤澎，2006）和PI5（Lee等人 届氢，2009），被檢測(cè)為在大分子代謝過程和碳水化合物衍生物結(jié)合方面富集 表達(dá)模式分析表明覆旭，在四個(gè)較好的親本雜種中退子，OSDCL2、PI33和PI5表現(xiàn)出加性表達(dá)模式型将，而PID2與父本R998和R308的表達(dá)模式接近寂祥，表現(xiàn)出顯性表達(dá)模式（圖2D）。 這些結(jié)果表明七兜，這些抗性位點(diǎn)可能是重要的雜種優(yōu)勢(shì)基因丸凭。

? 基于等位基因特異性表達(dá)的雜種優(yōu)勢(shì)遺傳模型和候選基因分析（ASE）

? 雜種中兩個(gè)親本等位基因表達(dá)水平之間的酶被認(rèn)為是雜種優(yōu)勢(shì)的機(jī)制（Shao et al。 , 2019) 為了了解ASE在雜種優(yōu)勢(shì)中的潛在作用，我們對(duì)親本間ASE的差異表達(dá)進(jìn)行了分析 根據(jù)ASE基因的表達(dá)模式贮乳，將雜種F1中的ASE基因（ASEGs）分為3類：（1）加性ASEGs：表達(dá)水平接近雙親平均值；（II）顯性基因：表達(dá)水平與一個(gè)親本顯著不同而與另一個(gè)親本相似 表達(dá)水平與父本相近的稱為雄性基因恬惯，與母本相近的稱為雌性基因向拆；和（III）超顯性基因：高于較好親本或低于較差親本的表達(dá)水平.

? 利用R498（http：//mbkbase.org/r498/）的基因組序列，在四個(gè)親本之間檢測(cè)到大量的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）酪耳。 作為變異檢測(cè)的參考序列浓恳，使用軟件GATK3（圖S2） 相對(duì)于參考基因組序列，我們?cè)赗308中隨機(jī)選擇了49個(gè)SNP碗暗，并設(shè)計(jì)引物來驗(yàn)證這些變異（表S5）颈将。 在設(shè)計(jì)的49對(duì)引物中，有45對(duì)能成功擴(kuò)增言疗。 對(duì)它們的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序晴圾，檢測(cè)到的變異與RNA-seq的信息完全一致，表明檢測(cè)到的親本之間的SNPs可用于分析F1雜種中的ASE噪奄。

? 在F1雜交種中鑒定了許多ASEG（表S6）死姚。 我們調(diào)查了每種類型的ASEGs的百分比，發(fā)現(xiàn)對(duì)于四個(gè)較好的親本雜交種勤篮，大約46.8%, 43.4%和31.3% 幼苗都毒、幼穗和灌漿期的加性基因, 約49.4%, 52.9%和62.9%為優(yōu)勢(shì)基因，只有3.8%, 3.8%和5.9% 在幼苗碰缔、幼穗和充實(shí)穗中是超顯性效應(yīng)基因（圖3A–C）.而對(duì)于中親雜種WR账劲，大多數(shù)ASEGs（58.1%, 77.7%和78%）在幼苗、幼穗和灌漿穗中分別表現(xiàn)為顯性效應(yīng)金抡。 還有瀑焦，大約26.4%, 1.3%和14.4% 在幼苗、幼穗和充實(shí)穗中為超顯性基因（圖3D–F）梗肝。 ASEGs的比例（46.8%, 43.4%, 31.3%）在較好的雜交組合中遠(yuǎn)高于（15.5%, 21.0%, 7.6%）蝠猬，而超親組合中顯性和超顯性基因的總比例（53 2%, 56 6%, 68 7%）低于中親雜種WR（84 5%, 79 0%, 92 4%）（表S6），表明加性和顯性基因在雜種優(yōu)勢(shì)中起著重要作用统捶，這與以前的研究一致（Guo et al , 2006)榆芦。

? 在四個(gè)較好的親本雜種中共有的顯性基因中，分別在三個(gè)測(cè)試組織中鑒定出94喘鸟、38和93個(gè)顯示雄性優(yōu)勢(shì)的重疊基因（圖3G）和70匆绣、36和3個(gè)顯示雌性優(yōu)勢(shì)的共享基因（圖3H）（表S7）。 僅在4個(gè)優(yōu)良親本組合中共有的父本顯性基因比母本顯性基因多什黑，尤其是在幼苗和灌漿期崎淳，表明父本（恢復(fù)系）比母本（不育系）更能發(fā)揮雜種優(yōu)勢(shì)。在重疊的雄性顯性基因中檢測(cè)到幾個(gè)重要的基因愕把，如OsMADS51拣凹、PID2森爽、Hd3a、Ehd1和Osgme1嚣镜，它們對(duì)雜種優(yōu)勢(shì)的形成非常重要（表S7）爬迟。 這一發(fā)現(xiàn)與（Huang等人之前的研究一致。 , 2015;魏等人 , 2021)

? F1雜種及其親本的DNA甲基化

? 為了探索DNA甲基化在雜種優(yōu)勢(shì)菊匿，特別是雜種優(yōu)勢(shì)中的作用付呕，我們研究了5個(gè)雜種及其親本的幼苗、幼穗和充實(shí)穗的甲基化譜（表S8）跌捆。 據(jù)觀察徽职，與其親本相比，4個(gè)較好親本雜種在幼苗中表現(xiàn)出增加的總DNA甲基化和CG和CHG甲基化佩厚，而中親F1雜種WR的甲基化水平與其兩個(gè)親本在幼苗中的平均值（MV）相似（圖4A姆钉，B），這表明雜種中的甲基化水平可能與其雜種優(yōu)勢(shì)水平相關(guān) 此外抄瓦，我們還觀察到育韩，與其親本相比，所有雜種的甲基化水平在圓錐花序中都有所增加（圖S3）闺鲸。 因此筋讨，我們研究了9個(gè)基因型（5個(gè)雜種和4個(gè)親本）的甲基化水平與其GYPP之間的相關(guān)性。 在所有的胞嘧啶環(huán)境中都觀察到了正相關(guān)性摸恍，特別是在幼苗的CG環(huán)境中悉罕，相關(guān)系數(shù)（R2）分別為0.645（mC），0,919（mCpG）立镶，0.739（mCHG）和0.181 （mCHH）（圖4C-f） 然而壁袄，穗中的甲基化水平與GYPP之間的相關(guān)性似乎不顯著或較弱（圖S4），這表明生長(zhǎng)早期的甲基化狀態(tài)可能在雜種優(yōu)勢(shì)的形成中發(fā)揮更重要的作用媚媒。

? 我們進(jìn)一步研究了在所有胞嘧啶背景下不同基因組功能區(qū)的甲基化狀態(tài)嗜逻。 我們發(fā)現(xiàn)在雜交體及其親本的不同基因組功能區(qū)中表現(xiàn)出不同的甲基化模式（圖4G）。 在genebody區(qū)域缭召，特別是外顯子區(qū)域栈顷，CG甲基化水平在這些品系中差異顯著，而CHG和CHH甲基化水平差異不顯著嵌巷。在包含轉(zhuǎn)座元件（TEs）的重復(fù)區(qū)中萄凤，非CG甲基化水平在這些品系之間表現(xiàn)出顯著差異，而在TEs中CG甲基化水平幾乎相同搪哪。在啟動(dòng)子和內(nèi)含子區(qū)域中靡努，這些細(xì)胞系在三種胞嘧啶背景中具有相似的總體甲基化水平模式 因此，基因體特別是外顯子的CG甲基化模式和TES中的非CG甲基化模式可能在雜種優(yōu)勢(shì)中起著至關(guān)重要的作用。

? 轉(zhuǎn)錄組和甲基化組譜之間的關(guān)聯(lián)分析

? 由于CG和CHG甲基化水平與GYPP顯著相關(guān)惑朦，我們進(jìn)一步分析了差異表達(dá)與CG和CHG甲基化之間的相關(guān)性兽泄。結(jié)果表明，差異表達(dá)與CHG甲基化呈顯著負(fù)相關(guān)漾月，其相關(guān)系數(shù)大于CG甲基化病梢，但5個(gè)雜交種之間CHG甲基化的相關(guān)系數(shù)幾乎相同（表1），這表明CHG甲基化對(duì)F1雜交種基因差異表達(dá)的影響可能大于CG甲基化栅屏，但可能與BPH無關(guān)。CG甲基化堂鲜，尤其是CG低甲基化與基因的差異表達(dá)顯著相關(guān)栈雳，但相關(guān)性不顯著或很弱（0.13和0.1中親雜交WR的）。 此外缔莲，在四個(gè)較好的親本雜交體中哥纫，超甲基化的相關(guān)系數(shù)比低甲基化的相關(guān)系數(shù)小得多，這至少可以部分解釋為什么在較好的親本雜交體中上調(diào)的基因比下調(diào)的基因多（表S3）痴奏。

? 此后蛀骇，我們調(diào)查了DEGs和差異甲基化基因之間的共享基因（DMGs）在相應(yīng)的配對(duì)組合中作為雜種優(yōu)勢(shì)的候選基因，并觀察到大約1/3的DEGs與4個(gè)較好親本雜種和它們的親本之間的差異甲基化直接相關(guān)（表S9）读拆，這與以前的研究一致（Eichten et al , 2013;Li等人 , 2015;Schmitz等人 , 2013)擅憔。因此，我們重點(diǎn)研究了4個(gè)超親雜種幼苗中DMGs和DEGs之間共享的基因檐晕，并鑒定了一些與產(chǎn)量或抽穗期相關(guān)的基因暑诸，如DTH2（Wu et al。 辟灰，2013）个榕，HWH1（Jiang等人 ，2008）芥喇，GLW7/OsSPL13（Si等人 , 2016;魏等人 西采，2021），HD5（Fujino等人 继控，2013）和HD1（Zhang等人 , 2012;圖5）械馆，可能是雜種優(yōu)勢(shì)形成的關(guān)鍵候選基因。值得注意的是武通，DHT2在4個(gè)較好的親本雜種與其母本W(wǎng)FB或RFB之間的所有配對(duì)組合中均被檢測(cè)到狱杰。值得注意的是，在5個(gè)雜交種及其親本中厅须，其基因體和啟動(dòng)子的甲基化程度不同仿畸，并且在WFB和RFB的啟動(dòng)子區(qū)檢測(cè)到基因組DNA序列的缺失（圖6和S5；表S10），這表明甲基化的差異可能是由DNA序列的結(jié)構(gòu)變異引起的

? 差異甲基化區(qū)（DMR）和雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)因子的分析

? 我們稱這些DMR為差異甲基化區(qū)错沽，并使用全基因組滑動(dòng)窗口方法（窗口大小為200bp簿晓，步長(zhǎng)為50bp）對(duì)4個(gè)親本之間以及親本與其5個(gè)F1雜種之間鑒定的DMR中的相關(guān)基因（非_TE基因）和TES進(jìn)行了注釋。 在不同的配對(duì)比較中鑒定出大量的DMR千埃，親本之間的DMR遠(yuǎn)多于F1雜種與其親本之間的DMR（表S11）憔儿，表明并非所有的甲基化差異都與雜種優(yōu)勢(shì)有關(guān)。然后放可，我們重點(diǎn)研究了不同胞嘧啶背景下親本間DMR的特征谒臼，以探索預(yù)測(cè)其F1雜種優(yōu)勢(shì)水平的潛在線索。在幼苗和幼穗中耀里，4個(gè)較好親本組合的CG DMR（R 998_對(duì)_WFB蜈缤、R 308_對(duì)_WFB、R 998_對(duì)_RFB和R 308_對(duì)_RFB）均多于相應(yīng)親本之間的CHH DMR冯挎，而在中親F1組合WR中底哥，其親本之間的CG DMR在所有3個(gè)測(cè)試組織中均少于CHH DMR。 因此房官，在作物育種中趾徽，通過研究生長(zhǎng)早期親本間不同胞嘧啶背景下的DMR特性，可以有目的地篩選親本翰守，培育具有雜種優(yōu)勢(shì)的新型雜交種孵奶。

? 由于5個(gè)F1雜種及其4個(gè)親本的CG基因體甲基化（GBM）的總體水平與產(chǎn)量相關(guān)性狀的表現(xiàn)高度一致，我們進(jìn)一步調(diào)查了成對(duì)比較中DMRs的分布蜡峰，特別是在不同功能區(qū)（包括外顯子拒课、內(nèi)含子和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSSs）的親本之間。表S12）事示。 我們觀察到早像，4個(gè)優(yōu)良雜種與其相應(yīng)親本之間的外顯子、內(nèi)含子和TSSs的CG DMR比中親雜種WR與其親本之間的CG DMR更多肖爵，尤其是在幼苗中卢鹦。 有趣的是，我們注意到劝堪，在所有三個(gè)測(cè)試組織中冀自，四個(gè)較好親本雜種的親本之間的外顯子中的DMR顯著少于中等親本雜種WR的親本之間的外顯子中的DMR，而四個(gè)較好親本雜種的雙親之間的TSSs中的DMR遠(yuǎn)多于中等親本雜種WR的雙親之間的TSSs秒啦。 5個(gè)雜交種的親本之間在內(nèi)含子中的DMR數(shù)量沒有顯著差異熬粗。 因此，外顯子和TSSs中CG DMRs在不同水稻親本間的分布特征似乎與其雜種優(yōu)勢(shì)水平相關(guān)余境。 進(jìn)一步的相關(guān)分析表明驻呐，外顯子中CG DMR的數(shù)量與雙親間呈顯著負(fù)（R2=0.99灌诅。 960）與其雜種的雜種優(yōu)勢(shì)水平呈正相關(guān)，而雙親間TSSs的CG DMR數(shù)呈正相關(guān)（R2=0含末。623）與其雜種的雜種優(yōu)勢(shì)水平相關(guān)（圖7A猜拾，B）。

? 由于外顯子中的CG DMR和親本之間的TSSs與其F1雜種的雜種優(yōu)勢(shì)水平表現(xiàn)出不同的相關(guān)性佣盒，我們計(jì)算了每個(gè)成對(duì)組合中外顯子中的CG DMR數(shù)量與TSSs中的數(shù)量的比率挎袜，以評(píng)估相關(guān)性（表S12）。 我們發(fā)現(xiàn)肥惭，在4個(gè)較好的親本雜種中盯仪，外顯子中CG DMR的數(shù)目與TSSs中CG DMR的數(shù)目的比值小于5（范圍為3.18比4.73),親本W(wǎng)FB與中親雜種WR的RFB之間的差異大于8（范圍為8.12至16.34）。 特別是在幼苗中蜜葱，該比率（16.34) WFB和RFB之間的差異遠(yuǎn)大于（4.03到4.73 小于5)全景。 4個(gè)）優(yōu)良雜交組合的親本間。 相關(guān)分析表明笼沥，親本間CG DMR數(shù)目與TSSs中CGDMR數(shù)目的比值與其雜種優(yōu)勢(shì)的大小呈極顯著負(fù)相關(guān)蚪燕，在幼苗娶牌、幼穗和充實(shí)穗中分別為相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.982, 0.962和0.991 （圖7C–E）奔浅，這意味著親本之間外顯子中的CG DMR數(shù)量與TSSs中的CG DMR數(shù)量的比率可以作為其F1雜種優(yōu)勢(shì)水平的可行預(yù)測(cè)指標(biāo)

? 為了驗(yàn)證上述推測(cè)，我們選擇了19個(gè)水稻品系诗良，包括17個(gè)在中國(guó)商業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用的雜交水稻親本品系（表S13）汹桦，并對(duì)移栽后20天（DATS）的幼苗進(jìn)行了甲基組學(xué)測(cè)序,在粳稻_與_粳稻、粳稻_與_秈稻鉴裹、秈稻_與_秈稻等25個(gè)配對(duì)組合中舞骆，外顯子的CG DMR數(shù)目與雙親TSSs的CG DMR數(shù)目之比分別小于3、小于5径荔、大于5和高達(dá)19.34,在粳稻_與_秈稻督禽、秈稻保持系_與_恢復(fù)系（及其相應(yīng)的F1雜種已廣泛用于水稻生產(chǎn)），秈稻保持系_與_保持系和粳稻_與_粳稻总处，分別為（圖7F狈惫；表S14）。 不同類型水稻品系間的比值趨勢(shì)與秈粳雜種F1>秈秈雜種F1>粳粳雜種F1的雜種優(yōu)勢(shì)大小正好相反（Shen et al鹦马。 , 2015). 因此胧谈，可以看出，外顯子中CG DMR數(shù)目與TSSs中CG DMR數(shù)目的比值與雜種優(yōu)勢(shì)水平之間的負(fù)相關(guān)性得到了進(jìn)一步證實(shí)荸频。據(jù)此推測(cè)菱肖，該比值可作為雜交水稻育種中預(yù)測(cè)雜種優(yōu)勢(shì)水平的直觀指標(biāo)，小于5的比值可作為判斷生長(zhǎng)發(fā)育早期雜種優(yōu)勢(shì)F1雜種的臨界指標(biāo)旭从。

? 討論

? 雜種優(yōu)勢(shì)的候選基因

? 在本研究中稳强，通過對(duì)4個(gè)較好親本雜交種和1個(gè)中親雜交種的轉(zhuǎn)錄組分析场仲，篩選出僅在4個(gè)較好親本雜交種中共享的DEG作為雜種優(yōu)勢(shì)的候選基因。 鑒定了數(shù)百個(gè)共享基因键袱，但它們中的大多數(shù)被富集到分子功能的術(shù)語中燎窘，只有一小部分上調(diào)的DEG被富集到代謝和磷酸化過程中，這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了大多數(shù)對(duì)雜種優(yōu)勢(shì)有貢獻(xiàn)的基因座對(duì)重要農(nóng)藝性狀影響較小的推斷（Schnable&Springer蹄咖，2013）褐健。

? 甲基化水平，特別是在CG和CHG背景下澜汤，與GYPP顯著正相關(guān)蚜迅。轉(zhuǎn)錄組和甲基化組譜之間的關(guān)聯(lián)分析顯示顯著相關(guān)。在4個(gè)較好親本的雜種中俊抵，約有1/3的差異表達(dá)基因也表現(xiàn)出差異甲基化谁不，表明這些基因的差異表達(dá)可能是由甲基化直接引起的。因此徽诲，我們將重點(diǎn)放在四個(gè)較好的親本雜種中的DEGs和DMGs之間的重疊基因作為BPH的關(guān)鍵候選基因刹帕。在這些共享基因中，一些重要的控制抗病性谎替、抽穗期和產(chǎn)量相關(guān)性狀的基因偷溺，如OsDCL2、Pi33钱贯、Pi5挫掏、DTH2、HD1秩命、EHD1尉共、DTH8、OsGME1和GLW7弃锐，被鑒定（黑色）中標(biāo)記的圖5袄友，這些基因以前被報(bào)道影響產(chǎn)量相關(guān)性狀或與雜種優(yōu)勢(shì)有關(guān)（Huang et al , 2015;Si等人,2016; Urayama 等人,2010; 魏等人,2010; 魏等人,2021) 抗病基因的感病位點(diǎn)可能具有重要的生物學(xué)功能，其突變通常會(huì)對(duì)植物生長(zhǎng)霹菊、發(fā)育和作物產(chǎn)量產(chǎn)生不良的多效性效應(yīng)（Li et al., 2022) 通過表觀遺傳機(jī)制和晝夜節(jié)律（Miller等人在脅迫條件下誘導(dǎo)脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)以抵抗病原體入侵剧蚣，并在非脅迫條件下促進(jìn)生物量雜種優(yōu)勢(shì)。 , 2015;Yang等人 , 2021) 此外浇辜，在中親雜種中也檢測(cè)到了DTH2券敌，并且在四個(gè)親本中也證實(shí)了其序列變異。據(jù)報(bào)道柳洋，DTH2與早抽穗和在長(zhǎng)日照條件下增加繁殖適合度相關(guān)（Wu等人 , 2013) 因此待诅，DTH2基因可能是華南雙季稻區(qū)的一個(gè)優(yōu)勢(shì)基因。

? 基因組DNA甲基化與雜種優(yōu)勢(shì)的分子機(jī)理

? 盡管幾十年來雜種優(yōu)勢(shì)在作物育種和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到了成功的應(yīng)用熊镣，但其分子機(jī)理仍不清楚卑雁。 越來越多的證據(jù)表明募书，基因組DNA甲基化對(duì)雜種優(yōu)勢(shì)有很大的影響，（Groszmann等人 , 2013;He等人 , 2013;勞斯等人 , 2018;Shen等人 , 2012)测蹲。 我們的工作表明莹捡，5個(gè)雜種及其4個(gè)親本的總體甲基化水平，尤其是在CG和CHG背景下扣甲，與其GYPP顯著正相關(guān)篮赢。

? 與親本相比，雜種F1在基因體上表現(xiàn)出不同的CG甲基化琉挖，在TEs上表現(xiàn)出不同的非CG甲基化启泣，表明DNA甲基化水平，尤其是基因體CG甲基化和TE非CG甲基化水平可能是雜種優(yōu)勢(shì)的關(guān)鍵示辈。已經(jīng)表明寥茫，在不同的胞嘧啶背景下，基因和TES上的DNA甲基化在植物中具有不同的調(diào)節(jié)作用（Zhang等人 , 2018) GBM在植物物種中高度保守矾麻，并且主要富集在組成型表達(dá)的管家基因中纱耻，（等 , 2015;Bewick&Schmitz，2017）险耀，表明身體甲基化基因在功能上很重要弄喘。甲基組與轉(zhuǎn)錄組的關(guān)聯(lián)分析表明，CG GBM胰耗，尤其是CG HYPO-GBM和CHG GBM與雜種F1基因的差異表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)限次。 CHG GBM的甲基化系數(shù)大于CG GBM的甲基化系數(shù)芒涡，表明CHG甲基化在雜種優(yōu)勢(shì)中起著重要作用（Ma et al , 2021) 然而柴灯，在我們的研究中，5個(gè)F1組合中CG GBM的相關(guān)系數(shù)與5個(gè)F1組合的雜種優(yōu)勢(shì)水平一致费尽，而CHG GBM的相關(guān)系數(shù)幾乎相同赠群。 這些結(jié)果表明，CHG GBM在雜種中的差異表達(dá)可能比CG GBM更重要旱幼，但CG GBM在雜種優(yōu)勢(shì)尤其是雜種優(yōu)勢(shì)的形成中比CHG GBM更重要查描。

? DNA甲基化標(biāo)記與雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)

? 眾所周知，迄今為止柏卤，篩選具有強(qiáng)雜種優(yōu)勢(shì)的F1雜種仍然是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)冬三。 遺傳學(xué)家和育種學(xué)家一直試圖在不同水平上尋找預(yù)測(cè)雜種優(yōu)勢(shì)的相關(guān)線索，包括遺傳距離（基因組水平缘缚。LaBorda等人 勾笆，2005），基因表達(dá)（轉(zhuǎn)錄組水平桥滨；米勒等人 窝爪，2015）弛车，非線性表型變異（表型組水平；Vasseur等人 蒲每，2019）和代謝組學(xué)途徑（代謝組學(xué)水平纷跛；Dan等人 , 2021) 越來越多的研究（Fernandes等人）表明，在多個(gè)物種中邀杏，遺傳距離與雜種優(yōu)勢(shì)的強(qiáng)弱并不完全相關(guān)贫奠。 , 2015;Silva等人 , 2019;Wang等人 , 2015;Yang等人 , 2017)。其他幾項(xiàng)組學(xué)研究不能簡(jiǎn)單直觀地預(yù)測(cè)雜種優(yōu)勢(shì)水平望蜡。 甲基化信息已被用于預(yù)測(cè)復(fù)雜的數(shù)量性狀叮阅，如pH和人類壽命（Horvath&Raj，2018泣特；Hu等人 , 2015)浩姥。 在我們的研究中，我們觀察到甲基化水平與GYPP之間的顯著相關(guān)性状您，以及CG DMR在較好親本和中等親本F1的親本之間基因體不同功能區(qū)域的不同分布特征勒叠。 據(jù)報(bào)道，GBM優(yōu)先出現(xiàn)在外顯子和內(nèi)含子上膏孟，很少出現(xiàn)在TSSs和轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)（Takuno&Gaut眯分，2013）。 相關(guān)分析還表明柒桑，外顯子的CG DMR和TSSs也分別與其F1雜種優(yōu)勢(shì)的大小呈負(fù)相關(guān)和正相關(guān)弊决。 用外顯子中CG DMR或TSSs的絕對(duì)數(shù)目來評(píng)價(jià)任何兩個(gè)親本之間的雜種優(yōu)勢(shì)水平并不容易和準(zhǔn)確。 它們的比值與相應(yīng)雜種F1的雜種優(yōu)勢(shì)水平顯著相關(guān)魁淳，相關(guān)系數(shù)也大于外顯子和TSSs中CG DMR的絕對(duì)數(shù)飘诗。 這種相關(guān)性也在來自另外19個(gè)不同類型的水稻品系的24個(gè)成對(duì)組合中得到證實(shí)。因此界逛，我們認(rèn)為外顯子中CG DMR與TSSs的比值是親本間雜種優(yōu)勢(shì)的潛在預(yù)測(cè)因子昆稿，而小于5的比值可能是基于本研究中所用的23個(gè)親本來判斷雜種是否具有雜種優(yōu)勢(shì)的關(guān)鍵指標(biāo)。