大家好，首先說明下昨天文章第二段有個錯誤，應(yīng)該是“缺氧誘導(dǎo)”缚柳，而不是“缺氧敏感”。謝謝小伙伴指出搪锣。今天我們要分享的文章是：

Zhang A, Zhao JC, Kim J, Fong KW, Yang YA, Chakravarti D, Mo YY, Yu J.LncRNAHOTAIREnhancesthe Androgen-Receptor-Mediated Transcriptional Program and Drives Castration-Resistant Prostate Cancer.Cell Rep. 2015 Oct 6;13(1):209-21.

這篇15年10月份的文章發(fā)表在Cell Rep?(IF 8.3)?上秋忙，研究的主題是LncRNA HOTAIR上調(diào)雄激素受體（AR）并激活下游轉(zhuǎn)錄事件促進前列腺癌生長，這篇文章與上篇發(fā)表在Mol Cell（?IF 14.0）的研究lincRNA P21與HIF-1α在缺氧微環(huán)境條件下反饋激活的文章相比淤翔，有以下幾個異同點：

1.?時間和IF翰绊，lincRNA P2114年1月（IF 14.0），LncRNA HOTAIR 15年10月?(IF 8.3)旁壮；

2.?兩篇文章研究的都是lncRNA监嗜，不過這篇文章選的是大名鼎鼎的HOTAIR,?在lncRNA領(lǐng)域基本是家喻戶曉的了；

3.?上篇文章的lincRNA P21與調(diào)控靶點HIF-1α形成了反饋回路抡谐，彼此激活裁奇；這篇文章則沒有，HOTAIR對AR的調(diào)控是開放的麦撵；

4.?在lncRNA對靶分子上調(diào)機制的闡述上刽肠，都是抑制泛素化介導(dǎo)的靶蛋白降解這一水平。實際上免胃，lncRNA上調(diào)靶分子表達的水平和方式有太多種音五，我們后面會選取多篇文章分別展開說明，這是題外話羔沙。

5.?最后躺涝，既然前篇文章完勝后面這篇文章，我們今天為什么還要講HOTAIR這篇文章呢扼雏？因為今天講的這篇文章選的角度不同坚嗜，我們主要講免疫共沉淀（immunoprecipitation夯膀，IP）及衍生技術(shù)在研究以蛋白為中心的蛋白—蛋白、蛋白—RNA苍蔬、蛋白—DNA相互作用的廣泛應(yīng)用诱建，所以關(guān)于文章本身的介紹會粗略一些，對文章感興趣的小伙伴可以從文末下載全文細看碟绑。

好了俺猿，先說下這篇文章的研究內(nèi)容：

1. lncRNA HOTAIR被雄激素抑制，在去勢抵抗前列腺癌（CRPC）中高表達蜈敢；

2.lncRNA HOTAIR通過抑制雄激素受體AR的泛素化降解上調(diào)AR表達辜荠；

3.lncRNA HOTAIR提高了AR介導(dǎo)的下游靶基因調(diào)控活性汽抚；

4.lncRNA HOTAIR以類似雄激素而非依賴的方式發(fā)揮促癌功能抓狭。

對于第1和第4部分我們簡單介紹，重點說明第2和3部分造烁。我們先看下文章的機制圖：

LncRNAHOTAIR?高表達否过，通過與AR直接結(jié)合，抑制了E3泛素酶MDM2介導(dǎo)的AR降解惭蟋，從而上調(diào)AR表達水平苗桂，并以雄激素非依賴的方式激活A(yù)R下游基因轉(zhuǎn)錄表達，促進CRPC細胞生長和侵襲告组。

在介紹全文以前煤伟，我們先科普幾個技術(shù)，IP木缝，RIP便锨，RNA Pulldown和CHIP。

IP我碟，immunoprecipitation放案，免疫共沉淀，檢測蛋白

RIP矫俺，RNA Immunoprecipitation吱殉，RNA免疫共沉淀，檢測RNA

RNA Pulldown厘托，檢測蛋白

CHIP,chromatin immunoprecipitation,?染色質(zhì)免疫共沉淀友雳，檢測DNA

第一部分：lncRNA HOTAIR被雄激素抑制，在去勢抵抗前列腺癌（CRPC）中高表達铅匹；

與上篇文章幾乎一致押赊，差別在臨床部分；

第二部分：lncRNA HOTAIR通過抑制雄激素受體AR的泛素化降解上調(diào)AR表達伊群，分為兩部分來說明：

1.?lncRNA HOTAIR與AR結(jié)合考杉；

2.?E3泛素酶MDM2與AR結(jié)合策精，而lncRNA HOTAIR抑制兩者結(jié)合。

為了證明lncRNA HOTAIR與AR結(jié)合崇棠，用RIP和RNA pull-down實驗分別明確HOTAIR與AR結(jié)合咽袜，并確定兩者結(jié)合的序列和結(jié)構(gòu)域。

為了證明lncRNA HOTAIR抑制E3泛素酶MDM2與AR結(jié)合

這一部分做了AR-MDM2的結(jié)合和lncRNA HOTAIR與AR的結(jié)合枕稀，與上篇文章方法非常像询刹。

第三部分.lncRNA HOTAIR提高了AR介導(dǎo)的下游靶基因調(diào)控活性；

這一部分是說HOTAIR對AR介導(dǎo)的下游靶基因調(diào)控活性的影響，在lincRNA-P21那篇文章里面對應(yīng)的是HIF-1α對lincRNA-P21的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)智润，都是轉(zhuǎn)錄因子蛋白對DNA的結(jié)合爪飘。

在這部分，主要強調(diào)的是lncRNA HOTAIR的作用蔽挠，通過CHIP-seq/qPCR

對AR結(jié)合事件進行的檢測。

第四部分：lncRNA HOTAIR激活AR不依賴雄激素瓜浸，發(fā)揮促癌功能澳淑。

當(dāng)然，如果有動物實驗就更好了插佛。

大家好杠巡，在上期的文章中，我們分享了lincRNA-P21通過結(jié)合翻譯調(diào)節(jié)蛋白Rck從而阻斷CTNNB1和JUNB mRNA翻譯雇寇，下調(diào)β-catenin?和?JunB表達水平的文章氢拥，今天繼續(xù)分享一篇文章：

Chenguang Gong,Zhizhong Li,Krishnan Ramanujan,Ieuan Clay,Yunyu Zhang,SophieLemire-Brachat,and David J. Glass.A Long Non-coding RNA, LncMyoD, Regulates Skeletal Muscle Differentiationby Blocking IMP2-Mediated mRNA Translation.Developmental Cell. (July 27, 2015) (IF9.7)

我們從換個角度看同樣是參與蛋白的翻譯，本文的主角LncMyoD與lincRNA-P21的作用機制有何不同锨侯。首先上機制圖：

呂小布LncMyoD是一條由MyoD臨近基因編碼的霸王lncRNA嫩海，在成肌細胞分化時直接由MyoD基因激活。原本貂小蟬IMP2（IGF2-mRNA-binding protein 2）與增殖基因董大卓（N-Ras识腿、c-Myc）愉快地結(jié)合在一起出革，激活增殖基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細胞增殖渡讼。而小霸王呂小布LncMyoD來了之后骂束，發(fā)現(xiàn)貂小蟬IMP2蠻不錯，直接搶先與之競爭性結(jié)合成箫，打壓貂小蟬IMP2之前介導(dǎo)的董大卓增殖基因的轉(zhuǎn)錄展箱，使得細胞增殖受到抑制，促使細胞分化蹬昌。

這篇文章的研究內(nèi)容主要包括以下幾點：

1.?發(fā)現(xiàn)和鑒定LncMyoD混驰，這一點我們看鑒定一條新的lncRNA，有哪些工作要做；

2.?LncMyoD促進成肌細胞分化栖榨，這部分簡單說明昆汹；

3.?LncMyoD上調(diào)表達機制：被蛋白MyoD轉(zhuǎn)錄激活，這部分是蛋白與DNA作用的常見實驗婴栽，前面已有文章涉及满粗；

4.?LncMyoD下游抑制蛋白翻譯機制，這點我們重點來看愚争。

首先映皆，是第一部分：LncMyoD的發(fā)現(xiàn)及圍繞LncMyoD所做的相關(guān)工作：

即新lncRNA鑒定工作之“”八部天龍：

1. RNA-seq找差異lncRNA

2.?根據(jù)基因位置關(guān)系確定候選lncRNA

3. RACE明確lncRNA序列

4.lncRNA在細胞內(nèi)的定位（空間特異性）；

5.lncRNA在組織內(nèi)表達特異性轰枝；

6.lncRNA表達的時間特異性捅彻；

7. lncRNA編碼蛋白能力預(yù)測；

8.lncRNA編碼蛋白能力驗證鞍陨；

以上八步驟基本涵蓋了我們在做新lncRNA研究時需要了解的基本信息步淹，其中第1和第2的內(nèi)容是我們前面一篇文章“（策略篇）千里挑一：挑選差異基因的七點策略”中的第一和第七點策略；第3點是明確lncRNA的序列和大小湾戳，因為lncRNA一般是大于200nt的贤旷；第4,5,6是研究的lncRNA表達的時間广料、空間和組織特異性砾脑；第7和8點是lncRNA不具備蛋白編碼能力的生物信息學(xué)預(yù)測和實驗結(jié)果。

另外艾杏，這部分還發(fā)現(xiàn)了LncMyoD的一個兄弟“LncMyoD*”韧衣，只不過在這篇文章中LncMyoD*不是主角，不過如果換個研究背景呢购桑？說不定LncMyoD*就是主角了畅铭，如果LncMyoD*與LncMyoD的功能相同？相反勃蜘？兩者表達之間怎么調(diào)控硕噩？說不定是一個新的課題哦！

第二部分是LncMyoD促進成肌細胞分化的功能實驗缭贡，這部分沒什么好說的炉擅。

第三部分：LncMyoD與鄰近基因MyoD的關(guān)系：MyoD介導(dǎo)LncMyoD的轉(zhuǎn)錄激活，從而上調(diào)LncMyoD表達阳惹。

我們在第一部分提到之所以挑選LncMyoD谍失，除了因為LncMyoD表達上調(diào)外，還因為LncMyoD與基因MyoD位置上相近莹汤，而MyoD是參與成肌細胞分化的重要基因快鱼。那么位置上的相近僅僅暗示兩者有調(diào)控，那么是LncMyoD調(diào)控MyoD？還是反過來抹竹？所以第一部分先確定兩者是否存在調(diào)控线罕，以及調(diào)控的上下有關(guān)系。結(jié)果表明：LncMyoD不影響MyoD表達窃判，而MyoD影響LncMyoD表達闻坚，說明MyoD在LncMyoD的上游。然后預(yù)測到LncMyoD有多個MyoD的結(jié)合序列E-BOX（類似于HIF-1α對lincRNA-P21調(diào)節(jié)的文章中的HRE）兢孝，后面用CHIP和熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CMyoD對LncMyoD的轉(zhuǎn)錄激活窿凤，是我們以前說過研究轉(zhuǎn)錄因子常見的三大方法之二。

另外跨蟹，如果LncMyoD同樣激活MyoD表達呢雳殊？那么就是LncMyoD-MyoD正反饋回路了，實際上窗轩，由于LncRNA與基因位置接近而調(diào)控周圍基因表達的例子還是比較多的夯秃，我們后面會選幾種模式來介紹給大家。

第四部分：LncMyoD對下游基因的調(diào)控方式痢艺，這部分是我們說明的重點。

首先作者為了尋找LncMyoD調(diào)控的靶基因色建，通過RNA pulldown找到了IMP2蛋白舌缤，并且發(fā)現(xiàn)LncMyoD表達沉默后IMP2的表達水平被上調(diào)箕戳，那么LncMyoD是如何調(diào)控IMP2的水平的呢？結(jié)果發(fā)現(xiàn)IMP2的轉(zhuǎn)錄活性和蛋白穩(wěn)定性都沒有變化国撵，有意思的是：IMP2的蛋白和mRNA能夠直接結(jié)合陵吸，從而增加其本身mRNA的穩(wěn)定性或翻譯，而LncMyoD表達沉默增加了IMP2蛋白和mRNA的結(jié)合介牙；然后，作者又發(fā)現(xiàn)LncMyoD除了能通過結(jié)合IMP2蛋白下調(diào)IMP2mRNA的水平外囚似，還可以與其它結(jié)合IMP2蛋白的mRNA分子競爭結(jié)合IMP2蛋白喳整，并下調(diào)其表達谆构。

這一部分確定LncMyoD與IMP2蛋白作用的方法是RNA Pull downh和RIP實驗，這是我們近幾期每次都說的實驗框都。值得一提的是搬素，這里L(fēng)ncMyoD與包括IMP2蛋白本身的mRNA等競爭結(jié)合IMP2蛋白呵晨，從而下調(diào)靶蛋白的方式熬尺，與我們以前說過的“聊基金系列?第三期:?競爭性內(nèi)源RNA（敵之?dāng)趁溃次嶂眩?/b>”很像，都是競爭某一類分子粱哼，但是結(jié)果是不同的季二，在競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）的機制里，lncRNA通過與靶基因的mRNA競爭結(jié)合microRNA揭措，從而正向調(diào)節(jié)靶基因的表達胯舷；而在這里，lncRNA通過與靶基因的mRNA競爭結(jié)合一類蛋白绊含，從而反向調(diào)節(jié)靶基因的表達桑嘶，至于后面這種方式能否成為一種研究模式，還要看后續(xù)的研究躬充。