????????代謝組學(xué)隸屬于組學(xué)范疇之內(nèi)，目前關(guān)注度頗高廷没，它是了解小分子代謝物質(zhì)（相對(duì)分子質(zhì)量小于1000）數(shù)量、種類过椎、豐度的研究技術(shù)间涵，可以對(duì)小分子物質(zhì)進(jìn)行全面的定性及定量分析钳幅，并尋找代謝物與環(huán)境因子變化的相對(duì)關(guān)系。然而扼睬，代謝組學(xué)涉及到的技術(shù)原理相對(duì)比較廣泛军俊，運(yùn)用的技術(shù)手段不同镰官，原理也略有不同提前。究其基本原理，則涉及到《現(xiàn)代儀器分析》這門學(xué)科泳唠，該學(xué)科下的波譜分析技術(shù)和色譜分析技術(shù)狈网，是目前代謝組學(xué)應(yīng)用的基礎(chǔ)原理，主要目的是進(jìn)行物質(zhì)分離和物質(zhì)分析警检。在此孙援，我們匯總了，現(xiàn)代儀器分析學(xué)科中與代謝組學(xué)相關(guān)的技術(shù)原理扇雕，并分享給大家拓售，以便于大家更好地理解代謝組學(xué)及其代謝組學(xué)研究開展的方式和方法。

主要內(nèi)容：

1.?儀器分析技術(shù)概念及種類

2.?代謝組學(xué)涉及的儀器分析方法

????a）波譜分析法????? ? b）色譜分析法

3.?分析儀器聯(lián)用技術(shù)（GC-MS镶奉、LC-MS础淤、……）

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1. 儀器分析技術(shù)概念及種類

1.1 什么是儀器分析技術(shù)

現(xiàn)代儀器分析技術(shù):?采用比較復(fù)雜或特殊的儀器設(shè)備鸽凶，以測(cè)量物質(zhì)的物理或物理化學(xué)性質(zhì)的參數(shù)及其變化來(lái)獲取物質(zhì)的化學(xué)組成、成分含量及化學(xué)結(jié)構(gòu)等信息的一類方法建峭。

1.2?儀器分析技術(shù)的分類

a.波譜分析：紫外可見分光光譜（UV）玻侥、核磁共振波譜分析（NMR）、質(zhì)譜分析（MS）……

b.色譜分析：液相色譜亿蒸、氣相色譜……

c.物相分析：磁選分析法凑兰、比重法掌桩、X射線結(jié)構(gòu)分析法……?

d.元素分析：電鏡能譜分析(EDS)、電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)……

2.?代謝組學(xué)涉及的儀器分析方法

一姑食、波譜分析法

主要原理：光的波粒二象性波岛。

光與物質(zhì)的相互作用：?

?????分子能級(jí)：分子處于特定的狀態(tài)，具有一定的能量音半；?

??????分子能級(jí)躍遷：分子吸收能量從低能級(jí)向高能級(jí)躍遷则拷；

?????分子光譜：分子吸收能量發(fā)生躍遷，吸收光子的波長(zhǎng)和吸收信號(hào)強(qiáng)弱曹鸠，為分子吸收光譜煌茬，反之，為分析發(fā)射光譜物延。

光譜的分類：分子平移宣旱、分子轉(zhuǎn)動(dòng)、化學(xué)鍵振動(dòng)叛薯、電子能級(jí)躍遷浑吟、電子自旋、同位素原子核自旋耗溜。

1? 核磁共振波譜（NMR）

NMR：一種研究原子核在磁場(chǎng)中能級(jí)及其躍遷的波譜方法组力。—分子結(jié)構(gòu)和分子間關(guān)

基本原理：

?????原子核的自旋運(yùn)動(dòng)：只有自旋不為零的核才能與外磁場(chǎng)發(fā)生作用抖拴，具有核磁共振的條件燎字；

?????核動(dòng)量矩和磁矩的空間量子化（原子核在外磁場(chǎng)中的行為）：在強(qiáng)磁場(chǎng)的激勵(lì)下，一些具有某些磁性的原子核的能量可以分為2個(gè)或2個(gè)以上的能級(jí)阿宅。?

?????核磁共振產(chǎn)生：此時(shí)候衍，外加一個(gè)能量，使其恰好等于裂分后相鄰兩個(gè)能級(jí)之差洒放，則該核可能吸收能量（稱為共振吸收）蛉鹿。??

從低能態(tài)向高能態(tài)，所吸收的能量的數(shù)量相當(dāng)于頻率范圍在0.1~100MHz的電磁波（屬于無(wú)線電波范疇往湿，射頻）妖异，因此，NMR就是研究磁性原子核對(duì)射頻能的吸收领追。

1.1? 弛豫過(guò)程—譜線寬度

縱向弛豫（自旋-晶格弛豫）：高能態(tài)的核與周圍環(huán)境（固體晶格他膳、液體中的溶劑分子等）進(jìn)行能量交換的過(guò)程。??

橫向弛豫（自旋-自旋弛豫）：高能太的核將能量傳遞給相鄰低能態(tài)自旋核的過(guò)程绒窑。??

譜線寬度的影響因素：弛豫時(shí)間棕孙、儀器磁場(chǎng)的均勻性、順磁性物質(zhì)。

1.2? 化學(xué)位移δ

化學(xué)位移：原子核所處的化學(xué)環(huán)境不同蟀俊，受到核外電子屏蔽作用不同分歇，其共振頻率各不相同，共振吸收峰將分別出現(xiàn)在NMR譜的不同頻段區(qū)域或不同磁場(chǎng)區(qū)域欧漱。??

化學(xué)位移的表示方法：相對(duì)位移，以某種物質(zhì)（TMS）的共振峰為原點(diǎn)葬燎，測(cè)序樣本中質(zhì)子共振峰與原點(diǎn)的相對(duì)距離误甚。——數(shù)據(jù)的統(tǒng)一谱净。

1.3? 核磁共振儀

儀器的分類：?

?????射頻頻率：60MHz窑邦，100MHz，600MHz……?

? ? ?磁體類型：永磁壕探，電磁冈钦，超導(dǎo)磁體……?

?????射頻源：連續(xù)波、脈沖傅里葉變換……?

儀器結(jié)構(gòu)：

核磁共振儀基本結(jié)構(gòu)

波譜示意圖

2. 質(zhì)譜（MS）

質(zhì)譜法即用電場(chǎng)和磁場(chǎng)將運(yùn)動(dòng)的離子（帶電荷的原子李请、分子或分子碎片瞧筛，有分子離子、同位素離子导盅、碎片離子较幌、重排離子、多電荷離子白翻、亞穩(wěn)離子乍炉、負(fù)離子和離子－分子相互作用產(chǎn)生的離子）按它們的質(zhì)荷比分離后進(jìn)行檢測(cè)的方法。

應(yīng)用：化合物結(jié)構(gòu)滤馍、定性和定量化學(xué)分析……

2.1? 采用質(zhì)譜法的原因

測(cè)出離子準(zhǔn)確質(zhì)量即可確定離子的化合物組成岛琼。由于核素的準(zhǔn)確質(zhì)量是一多位小數(shù)，決不會(huì)有兩個(gè)核素的質(zhì)量是一樣的巢株，而且決不會(huì)有一種核素的質(zhì)量恰好是另一核素質(zhì)量的整數(shù)倍槐瑞。

2.2? 基本原理

????樣本進(jìn)入質(zhì)譜儀器，在質(zhì)譜儀離子源中纯续，化合物被電子轟擊随珠，電離成分子離子和碎片離子，這些離子在質(zhì)量分析器中猬错，按質(zhì)荷比大小順序分開窗看，經(jīng)過(guò)電子倍增器檢測(cè)，即可得到化合物的質(zhì)譜圖倦炒。

2.3? 質(zhì)譜圖

橫坐標(biāo)：質(zhì)荷比?

縱坐標(biāo)：離子強(qiáng)度?

離子絕對(duì)強(qiáng)度：樣本量和儀器的靈敏度?

離子相對(duì)強(qiáng)度：樣本分子結(jié)構(gòu)相關(guān)?

同一樣品显沈，在一定的電離條件下得到的質(zhì)譜圖是相同的。這是質(zhì)譜進(jìn)行有機(jī)定性分析的基礎(chǔ)。

質(zhì)譜示意圖

?2.4? MS儀主要結(jié)構(gòu)

MS儀主要結(jié)構(gòu)

二拉讯、色譜分析法

一種分離涤浇、分析方法；?

特點(diǎn)：有兩相—固定相魔慷、流動(dòng)相只锭，兩相相對(duì)運(yùn)動(dòng)。

分離原理：當(dāng)流動(dòng)相中所攜帶的混合物通過(guò)固定相時(shí)院尔，會(huì)和固定發(fā)生作用蜻展，由于流動(dòng)相中各組分性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的差異，與固定相之間作用力的大小也有差異邀摆。因此纵顾，在同一推動(dòng)了作用下，不同組分在固定相中的滯留時(shí)間有長(zhǎng)有短栋盹，從而按先后不同次序從固定相中留出施逾。

1.1組分分離的影響的因素

組分分離的影響的因素

1.2色譜的基本理論

A.色譜分配平衡

色譜分配平衡：組分在固定相和流動(dòng)相之間發(fā)生的吸附，脫附或溶解例获、揮發(fā)等作用的過(guò)程—分配過(guò)程汉额。在一定溫度下組分在兩相間分配達(dá)到平衡時(shí)的濃度比，稱為分配系數(shù)躏敢；質(zhì)量比稱為分配比闷愤。

分配系數(shù)：色譜分離的實(shí)質(zhì)。

B. 塔板理論

塔板理論借助于化工中的塔板理論概念推導(dǎo)出流出曲線方程件余。

精餾塔示意圖

????????將色譜柱比作蒸餾塔讥脐，把一根連續(xù)的色譜柱設(shè)想成由許多小段組成。在每一小段內(nèi)啼器，一部分空間為固定相占據(jù)旬渠，另一部分空間充滿流動(dòng)相。組分隨流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱后端壳，就在兩相間進(jìn)行分配告丢。并假定在每一小段內(nèi)組分可以很快地在兩相中達(dá)到分配平衡，這樣一個(gè)小段稱作一個(gè)理論塔板（theoreticalplate）损谦，一個(gè)理論塔板的長(zhǎng)度稱為理論塔板高度（theoretical plateheight）H岖免。經(jīng)過(guò)多次分配平衡，分配系數(shù)小的組分照捡，先離開蒸餾塔颅湘，分配系數(shù)大的組分后離開蒸餾塔。由于色譜柱內(nèi)的塔板數(shù)相當(dāng)多栗精，因此即使組分分配系數(shù)只有微小差異趋急，仍然可以獲得好的分離效果。

氣尖滚、固相交換示意圖

a）組分濃度與時(shí)間的關(guān)系：流出曲線方程

流出曲線方程

解釋的問(wèn)題：色譜峰圖形和最大濃度位置。

b）色譜柱的理論塔板高度為單位柱長(zhǎng)度的色譜峰方差

理論塔板高度越低新博，在單位長(zhǎng)度色譜柱中就有越高的塔板數(shù)，則分離效果就越好脚草。

決定理論塔板高度的因素有：固定相的材質(zhì)赫悄、色譜柱的均勻程度、流動(dòng)相的理化性質(zhì)以及流動(dòng)相的流速等馏慨。

c）理論塔板數(shù)&有效塔板數(shù)

理論塔板數(shù)公式

有效塔板數(shù)：取決于固定相的種類涩蜘、性質(zhì)（粒度、粒徑分布等）熏纯、填充狀況、柱長(zhǎng)粤策、流動(dòng)相的種類和流速及測(cè)定柱效所用物質(zhì)的性質(zhì)樟澜。

柱效率

圖解法確定理論塔板數(shù)

d）塔板理論的特點(diǎn)與不足

塔板理論方程符合色譜流出曲線，為色譜理論提供指導(dǎo)??

用（有效）塔板數(shù)和（有效）塔板高度衡量柱效能指標(biāo)時(shí)叮盘，應(yīng)指明特定物質(zhì)（不同物質(zhì)在同一色譜柱上的分配系數(shù)不同）秩贰。?

沒(méi)有闡明影響柱效的本質(zhì)

?????柱效不能表示被分離組分的實(shí)際分離效果；?

?????無(wú)法指出影響柱效的因素和提高柱效的途徑柔吼。?

解釋不了載氣速率對(duì)理論塔板數(shù)的影響?

?????無(wú)法解釋同一色譜柱在不同載氣速率下柱效不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果毒费。

C. 速率理論

速率理論認(rèn)為：單個(gè)組分分子在色譜柱內(nèi)固定相和流動(dòng)相間要發(fā)生千萬(wàn)次轉(zhuǎn)移，加上分子擴(kuò)散和運(yùn)動(dòng)途徑等因素愈魏，它在柱內(nèi)的運(yùn)動(dòng)式高度不規(guī)則的觅玻，是隨機(jī)的，在柱中隨流動(dòng)相前進(jìn)的速率是不均一的培漏。

速率理論示意圖

?a）范第姆特方程式（VanDeemeter速率理論方程）

Van Deemeter速率理論方程

b）A—渦旋擴(kuò)散項(xiàng)

渦旋擴(kuò)散項(xiàng)

分子擴(kuò)散項(xiàng)

傳質(zhì)阻力

最佳流速

f）改善柱效的措施

選擇顆粒較小的均勻填充料溪厘；

在不使固定液粘度增加太多的前提下，應(yīng)在盡可能低的柱溫下操作牌柄；??

用最低實(shí)際濃度的固定液畸悬；?

用較大分子量載氣；?

選擇最佳的載氣流速珊佣；采用較小內(nèi)徑和較大曲率半徑的柱形蹋宦。

D. 分離度

分離度：描述物質(zhì)實(shí)際分離效能（塔板理論和速率理論難以描述）。??

分離度影響因素：熱力學(xué)因素（保留值）咒锻、動(dòng)力學(xué)因素（峰寬冷冗、柱效）。?

分離度的情況：?

①柱效較高虫碉，分配系數(shù)較大贾惦，完全分離；?

②分配系數(shù)不是很大，柱效高须板，峰較窄碰镜，基本上完全分離；?

③柱效較低习瑰，分配系數(shù)較大绪颖，但分離不好；?

④分配系數(shù)小甜奄，柱效低柠横，分離效果差。

分離度示意圖

?1.3?氣相色譜（GC）

以氣體為流動(dòng)相的色譜分析方法：??

適合于分離分析易氣化课兄、穩(wěn)定牍氛、不易分解、不易反應(yīng)的樣品烟阐，特別適合同系物搬俊，同分異構(gòu)體的分離。

a）氣相色譜的基本原理

氣相色譜基本原理示意圖

b）氣相色譜儀（GC）及其主要結(jié)構(gòu)

氣相色譜儀主要結(jié)構(gòu)

1.4? 高效液相色譜（HPLC）

以液體為流動(dòng)相的色譜法蜒茄；?

適合于分離高沸點(diǎn)唉擂，熱不穩(wěn)定，離子型的樣品檀葛。?

經(jīng)典LC：分離手段玩祟；HPLC：分離和分析。

基本原理：色譜過(guò)程中不同組分在相對(duì)運(yùn)動(dòng)屿聋，不相混溶的兩相間進(jìn)行交換空扎，相對(duì)靜止的一相為固定相，相對(duì)運(yùn)動(dòng)的相為固定相润讥，利用吸附勺卢，分配，離子交換象对，親和力或分子大小等性質(zhì)的微小差別黑忱，經(jīng)過(guò)連續(xù)多次在兩相間進(jìn)的質(zhì)量交換，使不同組分得到分離勒魔。

四種類型：吸附色譜甫煞，分配色譜，凝膠色譜冠绢，離子色譜抚吠。

a）液相色譜儀主要及其主要結(jié)構(gòu)

液相色譜主要結(jié)構(gòu)

3. 分析儀器聯(lián)用技術(shù)（GC-MS、HPLC-MS……）

3.1 分析儀器聯(lián)用技術(shù)概述

分析儀器聯(lián)用技術(shù)：將兩臺(tái)或多臺(tái)分析儀器結(jié)合到一起使用的技術(shù)弟胀，得到快捷楷力、有效的分析工具喊式。?

色譜最大特點(diǎn)是能將復(fù)雜的混合物分離成單一組分，但定性和結(jié)構(gòu)能力較差萧朝。

質(zhì)譜等技術(shù)對(duì)一個(gè)純組分結(jié)構(gòu)確定較為容易岔留。

分析儀器聯(lián)用形成對(duì)混合物質(zhì)的完整分析。

3.2 分析儀器之間聯(lián)用的重要問(wèn)題

接口問(wèn)題检柬，其一般要求如下：?可進(jìn)行有效的樣品傳遞献联；?

?????樣品傳遞要有良好的重現(xiàn)性；?

?????容易滿足兩個(gè)儀器任意選用的操作模式和條件何址；?

?????樣品通過(guò)接口不發(fā)生化學(xué)變化里逆；?

?????不影響儀器效能；?

?????樣品經(jīng)過(guò)接口的速度盡可能快用爪；?

?????接口本身操作簡(jiǎn)單原押、方便、可靠偎血。

3.3 氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)

綜合GC和MS的有點(diǎn)班眯，具有GC的高分辨率和質(zhì)譜的高靈敏度、強(qiáng)鑒別能力烁巫。??

適宜小分子，易揮發(fā)宠能，熱穩(wěn)定亚隙，能氣化的化合物；??

用電子轟擊方式（EI）违崇，得到的譜圖可以跟標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫(kù)比對(duì)阿弃。

3.4 高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）聯(lián)用技術(shù)

液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）可以解決如下幾方面問(wèn)題：

?????不會(huì)發(fā)化合物分析測(cè)定；?

?????極性化合物的分析測(cè)定羞延；

?????熱不穩(wěn)定化合物的分析測(cè)定渣淳；

?????大分子量化合物（包括蛋白、多肽伴箩、多聚物等）的分析測(cè)定入愧；?

?????沒(méi)有商品話的譜庫(kù)可對(duì)比查詢，只能自己建庫(kù)或自己解析圖譜嗤谚。?

要解決的重要問(wèn)題：?

?????液相色譜流動(dòng)對(duì)質(zhì)譜工作條件的影響棺蛛；?

?????質(zhì)譜離子源的溫度對(duì)液相色譜分析源的影響。

3.5?GC-MS& LC-MS 聯(lián)用技術(shù)儀器的主要結(jié)構(gòu)

GC-MS & LC-MS 聯(lián)用技術(shù)