? ? ? ? R-loops是一種含RNA-DNA雜合體的三鏈結(jié)構(gòu)榨为，經(jīng)常在轉(zhuǎn)錄中形成痕支。R-loop的錯誤調(diào)控與DNA損傷、轉(zhuǎn)錄延伸缺陷罕拂、過度重組和基因組不穩(wěn)定性有關(guān)。與這種非計劃的R-loops形成對比的是：越來越多的證據(jù)表明堡纬，細(xì)胞利用有計劃的調(diào)節(jié)性R-loops中的RNA-DNA雜交體來促進(jìn)DNA事件聂受，包括轉(zhuǎn)錄終止和基因調(diào)控的事件蒿秦、端粒穩(wěn)定性和DNA修復(fù)烤镐。由細(xì)胞內(nèi)RNAs形成的R-loops可以調(diào)控組蛋白翻譯后修飾，并可能被專門的閱讀蛋白所識別棍鳖。R-loops的雙面性意味著它們的形成炮叶、所在位點和及時去除必須受到嚴(yán)格控制碗旅。從這個角度出發(fā)，本文討論了調(diào)節(jié)性R-loops所調(diào)節(jié)的細(xì)胞進(jìn)程镜悉、R-loops的調(diào)控機(jī)制以及調(diào)節(jié)性R-loops和非計劃的R-loops之間可能存在的差異祟辟。

? ? ? ? 過去的十年徹底改變了我們對調(diào)節(jié)性RNA的認(rèn)識。通過使用下一代測序侣肄，已經(jīng)認(rèn)識到基因組的很大一部分會被轉(zhuǎn)錄旧困，有無數(shù)不同長度的RNA具有潛在的調(diào)控功能。雖然一些非編碼RNA（ncRNAs）的生物學(xué)研究已經(jīng)相當(dāng)成熟稼锅，但對其他ncRNAs調(diào)控功能的了解仍處于初級階段或難以捉摸吼具。RNA以序列特異性的方式在基因組中發(fā)揮調(diào)節(jié)功能的一種方式是通過形成RNA-DNA雜交體。術(shù)語RNA-DNA雜交指的是RNA與DNA的堿基配對矩距。當(dāng)RNA-DNA雜交體的形成導(dǎo)致單鏈DNA?（ssDNA）游離時拗盒，這種結(jié)構(gòu)稱為R-loop。RNA-DNA雜交體和R-loops在各種細(xì)胞進(jìn)程中發(fā)揮了重要的作用锥债，如基因調(diào)控和DNA修復(fù)陡蝇，近年來受到人們的廣泛關(guān)注。矛盾的是哮肚，R-loops長期以來一直被認(rèn)為是有害的轉(zhuǎn)錄副產(chǎn)物登夫，它干擾轉(zhuǎn)錄過程本身，并導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性绽左。R-loop誘導(dǎo)的基因組壓力與未能及時去除R-loops直接相關(guān)悼嫉。雜交體代謝障礙的許多負(fù)面后果是由于DNA復(fù)制機(jī)制與R-loops相遇而引起的復(fù)制應(yīng)激引起的；然而拼窥，R-loops相關(guān)的轉(zhuǎn)錄延伸缺陷戏蔑、DNA雙鏈斷裂（DSB）形成、突變發(fā)生和染色質(zhì)狀態(tài)改變也能夠以復(fù)制無關(guān)的方式發(fā)生鲁纠。有很多優(yōu)秀的綜述文章涵蓋了失控R-loops的有害影響总棵，并涉及R-loops的去除因素。

? ? ? ? 從這個角度出發(fā)改含，本文將討論RNA-DNA雜交體和R-loops是如何被用作某些DNA事件的正調(diào)控因子和信號情龄，重點放在轉(zhuǎn)錄調(diào)控和基因組完整性的維護(hù)上。然而捍壤，我們并不忽視R-loops的有害方面骤视，它可以影響完全相同的過程。我們也討論了可能決定R-loops和RNA-DNA雜交體命運的因素鹃觉，以及這些因素如何影響雜交體是否具有調(diào)節(jié)性和生產(chǎn)性专酗，或者是否具有計劃性和非計劃性/危害性。

非R-loop雜交體的作用

? ? ? ? 幾十年來盗扇，人們已經(jīng)知道RNA-DNA雜交體在各種核內(nèi)進(jìn)程中起著關(guān)鍵作用祷肯，尤其是轉(zhuǎn)錄和DNA復(fù)制沉填。在DNA合成過程中，后隨鏈的復(fù)制一個RNA-DNA雜交體功能的典型實例：DNA聚合酶α合成的RNA引物被DNA聚合酶δ聚合為成熟的岡崎片段佑笋。另一個RNA-DNA雜交體的功能實例發(fā)生在端粒上翼闹，端粒酶通過RNA-DNA堿基配對特異性地識別端粒序列，端粒酶由ncRNA和逆轉(zhuǎn)錄酶組成蒋纬。端粒酶的RNA部分與存在于染色體末端的3′ ssDNA延伸雜交猎荠，使末端的延伸能夠防止端粒被侵蝕。通常蜀备，當(dāng)復(fù)制中的DNA聚合酶（最常見的為DNA聚合酶ε）將三磷酸核糖核酸錯誤引入到新合成的DNA鏈時法牲，RNA-DNA“小型雜交體”就會形成。如果不有效地切除琼掠，錯配的單磷酸核糖核酸（rNMPs）可能會損害基因組的完整性拒垃；但它們在DNA修復(fù)過程中也發(fā)揮著積極的作用，因為錯配修復(fù)和非同源末端連接途徑利用核糖核酸插入來促進(jìn)基因組的完整性瓷蛙。在錯配修復(fù)的情況下悼瓮，rNMPs作為一種鏈識別信號，在新合成的鏈而不是模板鏈上指導(dǎo)錯配堿基的修復(fù)艰猬。rNMPs如此豐富（在酵母中每個細(xì)胞周期有13000個rNMPs）的事實也暗示了其具有生物學(xué)功能横堡。rNMPs在基因組中的積極和消極作用表明：它們是短暫的，受到嚴(yán)格的調(diào)控冠桃，以確保DNA的最佳修復(fù)命贴，同時避免基因組不穩(wěn)定性。上述雜交體不被認(rèn)為是R-loops食听，因為它們不會導(dǎo)致DNA鏈游離胸蛛。

R-loop的形成與分布

? ? ? ? R-loops是由RNA-DNA雜合體和游離的DNA單鏈組成的三鏈結(jié)構(gòu)。R-loop的特征已經(jīng)在一些優(yōu)秀的綜述中被廣泛討論過樱报。簡單地說葬项，三鏈結(jié)構(gòu)通常但不完全與正在進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄有關(guān)，直到最近還被認(rèn)為僅僅是轉(zhuǎn)錄的“副產(chǎn)物”迹蛤，只以順式（in?cis）發(fā)生在轉(zhuǎn)錄位點上民珍。負(fù)超螺旋以及RNA聚合酶附近發(fā)生的DNA變性（鏈分離），為新生轉(zhuǎn)錄本提供了一個理想的機(jī)會：以退火互補模板鏈盗飒，形成一個R-loop赤拒。雖然RNA-DNA雜交體不斷地在RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄泡內(nèi)形成帘不，但R-loops不太可能僅僅是這種有限雜交體的延伸耗绿，而更可能是通過RNA的5′端再入侵所形成的吓妆。RNA聚合酶復(fù)合物的結(jié)構(gòu)證實了這一點，RNA和DNA從復(fù)合物中以不同的出口通道被擠出汗贫，這將簡單地阻止R-loop擴(kuò)展形成身坐。此外，最近的一項研究表明落包，共轉(zhuǎn)錄R-loops的有效形成需要一個自由的RNA末端和一個GC偏倚（雙鏈之間鳥嘌呤和胞嘧啶分布的不對稱性）部蛇。當(dāng)RNA在不同的空間位置產(chǎn)生時，也可以形成反式（in?trans）RNA-DNA雜交體咐蝇。

? ? ? ? RNA-DNA雜交體的檢測方法對于理解R-loops是如何被調(diào)控的涯鲁，以及定位它們在基因組中形成的位置和時間是至關(guān)重要。雖然檢測RNA-DNA雜交體的主要工具是單克隆雜交特異性S9.6抗體有序，但替代試劑和技術(shù)已經(jīng)出現(xiàn)抹腿。催化失活的核糖核酸酶H1（RNase H1，一種能夠降解RNA-DNA雜交體的RNA部分）或RNase H1雜交體結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合熒光蛋白的酶可以用作雜交體的感受器旭寿。雖然雜交體的積累位點分布有普遍的共識警绩，但不同檢測方法仍會造成不同研究之間的差異。R-loops的一個守恒特征是它們的瞬時特性盅称。這是在一項使用芽殖酵母的研究中首次提出的肩祥，該研究表明：只有當(dāng)兩種RNaseH都缺失時，才能檢測到均勻分布的RNA-DNA雜交體核染色缩膝。這表明混狠，雜交體經(jīng)常出現(xiàn)，但會被RNaseH迅速去除疾层，至少部分去除将饺。隨后，除了RNaseH之外痛黎，多種解旋酶也被證明有助于雜交體的去除予弧。細(xì)胞核中分散的S9.6染色結(jié)果也表明，RNA-DNA雜交體在基因組的多個位點形成湖饱。這一結(jié)果在對酵母中雜合體位點進(jìn)行全基因組測序后同樣得到驗證：結(jié)果顯示酵母中雜交體位點廣泛分布桌肴，包括逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子、端粒和高表達(dá)基因（如核糖體RNA琉历、tRNA基因座和其他結(jié)構(gòu)性ncRNAs）中大量存在坠七。

? ? ? ? R-loops在與反義轉(zhuǎn)錄相關(guān)的基因上顯著富集，最近被證明其可以直接促進(jìn)反義表達(dá)旗笔，表明它們在基因表達(dá)中起調(diào)節(jié)作用（見下文）彪置。盡管有一項研究表明，在AT偏倚區(qū)域蝇恶，特別是poly(A)區(qū)域可能是R-loop形成的熱點區(qū)域拳魁；但普遍的共識是，?R-loop積累的關(guān)鍵決定因素不是序列本身撮弧，而是基因座的轉(zhuǎn)錄率潘懊。事實上姚糊，通過改變啟動子來提高轉(zhuǎn)錄率，一個R-loop缺失的位點就可以轉(zhuǎn)化為R-loop富集位點授舟。有一種傾向是富含GC的序列有更多的R-loops救恨；同樣的研究顯示，酵母中富含GC序列的基因通常表達(dá)水平更高释树。在哺乳動物細(xì)胞中肠槽，GC偏倚十分有利于R-loop的形成（見下文）。然而奢啥，酵母基因組并無太多的GC偏倚秸仙，除了端粒區(qū)域。在植物中桩盲，GC偏倚和AT偏倚的區(qū)域都富集于R-loops中寂纪。高表達(dá)水平和R-loops之間的聯(lián)系表明：要么高轉(zhuǎn)錄率促進(jìn)R-loops積累，要么R-loops促進(jìn)高轉(zhuǎn)錄率赌结。也可以設(shè)想這么一個正反饋：通過轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致R-loops的積累弊攘，從而再進(jìn)一步促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。注意姑曙，已知R-loops是轉(zhuǎn)錄的有效抑制劑襟交，會導(dǎo)致聚合酶停滯。R-loops與轉(zhuǎn)錄之間的矛盾關(guān)系表明伤靠，要維持高轉(zhuǎn)錄率捣域，需要嚴(yán)格控制R-loops的持久性（半衰期），或者R-loops與開放閱讀框之間存在空間分離宴合。

? ? ? ? 一項對酵母的研究發(fā)現(xiàn)焕梅，RNA聚合酶Ⅱ（Pol?Ⅱ）的一個亞基定位和R-loop熱點區(qū)域之間的基因組重疊很少。這表明通過S9.6 DRIP繪制的R-loop圖譜并不是記錄正在進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄卦洽，而是一些可能持續(xù)存在或轉(zhuǎn)錄后形成的R-loops贞言。這是一個早期跡象——表明R-loops可能不僅僅是轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，并暗示雜交體可能獨立于轉(zhuǎn)錄形成阀蒂，即以反式存在或從遠(yuǎn)處影響轉(zhuǎn)錄该窗。

? ? ? ? 與酵母相似，R-loops在人類細(xì)胞和植物中在重復(fù)序列處所積累蚤霞，如轉(zhuǎn)座子酗失、核糖體DNA、著絲粒和端粒昧绣。令人驚訝的是规肴，在人類和植物中，R-loops在承載CpG島（CGIs）的啟動子區(qū)域也顯著富集。CGIs存在于大約60%的人類基因的啟動子上拖刃，其1個特征是陽性GC偏倚（GC skew+）的存在——在轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）下游的非模板鏈上删壮，G比C富集。在啟動子區(qū)域更精確的R-loop定位表明兑牡，R-loops通常限制在TSS和第一個內(nèi)含子-外顯子聯(lián)接體之間央碟。一般來說，強(qiáng)烈的GC偏倚與高基因表達(dá)发绢、R-loop富集相關(guān)。以這種序列特異性方式積聚R-loops垄琐，可能是由于富含G的RNA對其互補序列具有特別強(qiáng)的熱力學(xué)結(jié)合特性边酒。此外，DNA二級結(jié)構(gòu)的存在狸窘，如G-四聯(lián)體（G4s）墩朦，在游離的DNA上可以促進(jìn)R-loop的穩(wěn)定性——阻止分解R-loops的蛋白質(zhì)進(jìn)入或降低DNA的再次退火能力。最近一項使用原子力顯微鏡的體外研究表明翻擒，R-loops可以獲得獨立于G4s的二級結(jié)構(gòu)氓涣。這些二級結(jié)構(gòu)是在游離的DNA鏈上形成的，包括斑點（blobs）陋气、刺（spurs）和環(huán)（loops）劳吠。這些R-loop構(gòu)象對周圍的DNA施加局部物理約束，例如彎曲DNA巩趁。一個有趣的可能性是痒玩，R-loop構(gòu)象可以編碼更高階的調(diào)控信息，如通過招募不同的染色質(zhì)修飾因子议慰。在未來蠢古，確定這些R-loop構(gòu)象是否存在于體內(nèi)的染色質(zhì)環(huán)境中是很重要的。

? ? ? ? 基因啟動子上R-loops的存在首次強(qiáng)烈表明該結(jié)構(gòu)可能具有重要的基因調(diào)控功能别凹。除了啟動子區(qū)域草讶，全基因組的研究發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄終止位點上R-loops也有相當(dāng)多的富集，特別是那些GC偏倚區(qū)域炉菲。這與R-loops促進(jìn)轉(zhuǎn)錄終止的功能是一致的堕战。同時，雜交體還出現(xiàn)于DNA損傷部位拍霜，包括功能缺失的端粒和DSB處践啄，在協(xié)調(diào)DNA修復(fù)中也具有重要的功能。

? ? ? ? 長期以來沉御，R-loops一直被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄的偶然副產(chǎn)物屿讽，對細(xì)胞生理有害，不適當(dāng)?shù)貏h除會導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性。然而伐谈，最近發(fā)現(xiàn)有一類有益的烂完、“調(diào)節(jié)性”的R-loops，在各種生物過程中扮演著重要的角色诵棵。調(diào)節(jié)性R-loops利用RNA-DNA堿基配對的序列特異性來排斥或靶向不同的染色體位點的輔因子抠蚣。原核生物中最重要的例子是CRISPR-Cas9系統(tǒng)，它在細(xì)菌中進(jìn)化成一種天然防御機(jī)制履澳，識別和破壞來自病毒的DNA嘶窄。在細(xì)菌基因組中，整合到CRISPR序列中的病毒DNA被轉(zhuǎn)錄并與Cas9核酸酶結(jié)合距贷，Cas9-RNA復(fù)合物在入侵的病毒DNA上形成一個序列互補的R-loop柄冲，使DNA產(chǎn)生斷裂，最終導(dǎo)致病毒DNA被破壞忠蝗。這個機(jī)制現(xiàn)在已經(jīng)被用作一個高度精確和易于工程化的基因編輯工具现横，使用guide RNAs將Cas9靶向到基因組中的特定序列，這一過程涉及到反式R-loop的形成阁最。

? ? ? ? 真核生物中調(diào)節(jié)性R-loops的第一個實例來自于免疫球蛋白重鏈位點的類開關(guān)重組研究：在G-rich的開關(guān)區(qū)域內(nèi)形成的R-loops促進(jìn)基于重組的缺失和驅(qū)動抗體類別轉(zhuǎn)換戒祠。RNA-DNA雜交體的序列特異性使R-loops通過精確靶向啟動子和終止子序列，成為調(diào)控基因表達(dá)的候選因子之一速种。

原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41580-019-0206-3

轉(zhuǎn)載自微信公眾號“YrSiyi小筆記”