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圖1|卡爾德斯蒙是收縮應(yīng)力纖維的動(dòng)態(tài)成分。一個(gè)具有代表性的3D-SIM圖像顯示升筏，Caldesmon定位于可收縮的腹側(cè)應(yīng)力纖維和橫向弧撑柔，但在U2OS細(xì)胞的非可收縮的背側(cè)應(yīng)力纖維中不存在。通過(guò)特異性抗體（上行）觀察內(nèi)源性卡爾德斯蒙您访，并應(yīng)用mCherry-Caldesmon構(gòu)建來(lái)確認(rèn)該蛋白的亞細(xì)胞定位（第二行）铅忿。我們用熒光熒光素觀察肌動(dòng)蛋白絲。在底部的面板是在上面的面板中用白色的盒子表示的區(qū)域的放大倍數(shù)灵汪。其中檀训，1柑潦、1‘和1“顯示背側(cè)應(yīng)力纖維缺失內(nèi)源性卡爾德斯蒙，2峻凫、2’和2”內(nèi)源性卡爾德斯蒙定位位于腹側(cè)應(yīng)力纖維渗鬼，3、3‘和3”卡爾德斯蒙定位位于橫弧荧琼，4譬胎、4’和4”內(nèi)源性卡爾德斯蒙定位位于皮質(zhì)應(yīng)力纖維。這些圖像總結(jié)了至少三個(gè)人的觀察結(jié)果
未經(jīng)處理的野生型U2OS細(xì)胞（圖b）的腹側(cè)應(yīng)力纖維命锄，5μM對(duì)氨基泡比他汀處理的U2OS細(xì)胞（圖c）堰乔，以及野生型U2OS細(xì)胞腹側(cè)應(yīng)力纖維中GFP-NM-IIA重鏈的動(dòng)態(tài)
e、恢復(fù)曲線表明脐恩，與NMII-A相比镐侯，卡爾德斯蒙是應(yīng)力纖維的高度動(dòng)態(tài)成分
f、GFP-卡爾德蒙在對(duì)照組和對(duì)氨基泡比他汀處理細(xì)胞中的恢復(fù)曲線提供了NM-IIA抑制不影響卡爾德蒙的動(dòng)力學(xué)驶冒。圖顯示了三個(gè)實(shí)驗(yàn)中n = 21個(gè)（卡爾德斯蒙對(duì)照）苟翻、18個(gè)（卡爾德斯蒙泡比他汀）和23個(gè)（NM-IIA對(duì)照）細(xì)胞的平均±掃描電鏡只怎。

Caldesmon is an extended protein and its N-terminal domain associates with the neck of myosin II filament

兩個(gè)不同蛋白質(zhì)帶了不同的標(biāo)記袜瞬，將看相互交聯(lián)的情況，用了5個(gè)不同的區(qū)域身堡，線的掃描看歸一化熒光強(qiáng)度邓尤，NMIIA tail 和FL 的分布，看了幾個(gè)不同點(diǎn)對(duì)應(yīng)的情況

a贴谎、從表達(dá)全長(zhǎng)卡爾德斯蒙的U2OS細(xì)胞中獲得的3D-SIM圖像的一個(gè)典型例子汞扎，其中mCherry（洋紅色）和GFP（綠色）分別融合到蛋白的N端和c端。右邊的面板是整個(gè)細(xì)胞圖像中用白色盒子表示的區(qū)域的放大倍數(shù)擅这。面板1‘中的黃線顯示了一個(gè)用于線掃描的區(qū)域的示例澈魄。比例尺，整個(gè)細(xì)胞10μm仲翎，放大圖像2μm
b痹扇、Cald-GFP的線形圖分析表明，卡爾德蒙的N端和c端GFP與mCherry之間的平均距離為~0.3μm溯香。線形圖顯示了來(lái)自三個(gè)細(xì)胞的n = 30細(xì)絲的歸一化熒光強(qiáng)度±掃描電鏡的平均值鲫构。
c、從表達(dá)mCherry-Caldesmon（洋紅色）的U2OS細(xì)胞中獲得的具有代表性的3D-SIM圖像玫坛，并用NM-IIA尾巴特異性染色
d表達(dá)mCherry-Cald（洋紅色）的U2OS細(xì)胞的代表性3D-SIM圖像结笨，并用NM-IIA RLC特異性抗體染色（綠色）。白色的盒子表示放大的區(qū)域。放大的圖像1‘顯示了一個(gè)用于線狀圖分析的NM-IIA線絲的例子炕吸。c和d面板伐憾，分別為5、2.5和1μm赫模。
e树肃、Caldesmonn端與NM-IIA尾共定位的線形圖分析。線掃描=意味著來(lái)自三個(gè)細(xì)胞的n個(gè)= 15個(gè)細(xì)絲的±掃描電鏡瀑罗。
f扫外、卡爾德斯蒙n端與NM-IIA RLC共定位。線掃描=意味著來(lái)自兩個(gè)細(xì)胞的n個(gè)= 22個(gè)細(xì)絲的±掃描電鏡廓脆。

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卡爾德斯蒙敲除細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)和遷移方面存在缺陷

a具有代表性的Western blot圖像顯示對(duì)照和卡爾德斯蒙寡聚1和寡聚2敲除（KO）U2OS克隆的全細(xì)胞裂解物中卡爾德斯蒙蛋白水平。選擇由oligo1和oligo2 Cas9構(gòu)建物產(chǎn)生的Caldesmon KO克隆2（第2和第6通道磁玉，綠色表示）進(jìn)行進(jìn)一步分析停忿。以GAPDH作為加載對(duì)照。
b野生型和卡爾德斯蒙寡核苷酸2敲除U2OS細(xì)胞的代表性廣域圖像蚊伞，在纖維連接蛋白涂層的弩形微模式上生長(zhǎng)席赂，并用文庫(kù)林特異性抗體和大肝素染色。與野生型細(xì)胞相比时迫，鈣素耗盡的細(xì)胞顯示出更少的應(yīng)力纖維網(wǎng)絡(luò)颅停。比例尺，10μm掠拳。
c和d通過(guò)對(duì)野生型癞揉、寡聚1KO和寡聚2KO細(xì)胞以及表達(dá)GFP-Caldesmon的oligo1 KO和oligo2 KO拯救細(xì)胞進(jìn)行高含量成像，分析細(xì)胞圓度（圖c）和細(xì)胞大心缗贰（圖d）
采用單因素方差分析進(jìn)行比較喊熟，然后采用Tukey多重比較檢驗(yàn)。p值經(jīng)過(guò)了多重比較的調(diào)整姐刁。誤差條表示0.05的顯著性水平芥牌，CI為95%。p值： ****p = 0.0001聂使。
e壁拉、通過(guò)野生型（n = 30）、寡聚1（n=37）柏靶、寡聚2（n=36）弃理、寡聚1=（n=24）（n=34）U2OS細(xì)胞的高含量成像獲得的隨機(jī)遷移速度的圖形表示。數(shù)據(jù)代表了四個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均±標(biāo)準(zhǔn)差宿礁。
f案铺、野生型、oligo2 KO和oligo2 KO拯救的U2OS細(xì)胞的代表性隨機(jī)遷移軌跡顯示了細(xì)胞的方向性。X軸和y軸上的值表示細(xì)胞從各自的平均位置遷移的程度控汉。
g笔诵、傷口愈合試驗(yàn)的代表性例子，說(shuō)明在0姑子、12和24 h的時(shí)間點(diǎn)乎婿，野生型和oligo1 KO細(xì)胞覆蓋的劃痕區(qū)域。比例尺街佑，400μm谢翎。
h、野生型沐旨、oligo1 KO和oligo2 KO U2OS細(xì)胞覆蓋的傷口面積百分比（%）的圖形分析森逮。x軸表示計(jì)算傷口覆蓋面積的%（y軸）的時(shí)間點(diǎn)h。這些值代表了三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均±標(biāo)準(zhǔn)差磁携。源數(shù)據(jù)為pr

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這些結(jié)果確定了Caldesmon是確保非肌細(xì)胞肌動(dòng)球蛋白束中規(guī)則的肌凝蛋白-ii間距的關(guān)鍵因素网沾，并揭示了應(yīng)力纖維網(wǎng)絡(luò)是如何通過(guò)原肌凝蛋白-的動(dòng)態(tài)交聯(lián)來(lái)控制的

收縮肌動(dòng)球蛋白束由薄的肌動(dòng)蛋白絲和厚的肌凝蛋白II絲組成癞蚕，是不同動(dòng)物細(xì)胞類型和組織中關(guān)鍵的作用力生產(chǎn)者和機(jī)械傳感器。它們包括橫紋肌的肌原纖維辉哥、平滑肌的收縮細(xì)絲和非肌肉細(xì)胞的應(yīng)力纖維1,2桦山。肌原纖維由規(guī)則的、重復(fù)的產(chǎn)生力和負(fù)重裝置組成醋旦，稱為肌節(jié)恒水，沿著肌動(dòng)蛋白絲的主要溝槽，允許肌動(dòng)蛋白-肌凝蛋白相互作用和肌肉收縮3饲齐。肌節(jié)內(nèi)的兩種結(jié)構(gòu)钉凌，z盤和m帶，將肌動(dòng)蛋白和肌凝蛋白II絲固定在一個(gè)由巨大的蛋白肌動(dòng)蛋白組成的彈性絲系統(tǒng)上捂人。z盤包含了來(lái)自相鄰肌節(jié)的α-肌動(dòng)蛋白交聯(lián)的反平行肌動(dòng)蛋白絲和幾個(gè)相關(guān)蛋白4,5御雕。肌節(jié)中心的m帶由六角形蛋白質(zhì)組成，包括肌凝蛋白滥搭，它們將肌凝蛋白II絲定位在肌節(jié)的中間酸纲，因此在控制肌肉收縮時(shí)的力不平衡方面至關(guān)重要6。雖然橫紋肌肌原纖維的結(jié)構(gòu)了解相對(duì)較清楚瑟匆，但對(duì)收縮肌動(dòng)球蛋白的了解卻知之甚少

肌滑肌和非肌細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)球蛋白束的組織是如何維持的闽坡，平滑肌和非肌細(xì)胞的力失衡是如何控制的一直是難以理解的。此外，應(yīng)力纖維和平滑肌肌動(dòng)球蛋白束不表達(dá)肌鈣蛋白復(fù)合物疾嗅，因此控制其收縮性的機(jī)制尚不完全清楚外厂。平滑肌細(xì)胞和非肌肉細(xì)胞缺乏橫紋肌肌原纖維的許多關(guān)鍵成分，如m帶蛋白

卡爾德斯蒙的n端_{200殘基區(qū)域與肌凝蛋白II和鈣調(diào)素14相互作用宪迟，c端}200殘基區(qū)域與肌動(dòng)蛋白絲酣衷、原肌凝蛋白和鈣調(diào)蛋白15-18結(jié)合。Caldesmon的c端區(qū)域在體外抑制了肌凝蛋白II的肌動(dòng)蛋白激活的atp酶次泽，鈣調(diào)蛋白與該區(qū)域的結(jié)合降低了其對(duì)f-肌動(dòng)蛋白的親和力穿仪，釋放了抑制作用

同時(shí)缺乏L-卡爾德斯蒙和H-卡爾德斯蒙的基因敲除小鼠在圍產(chǎn)期死亡25，而H-卡爾德斯蒙的特異性缺失會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈肌肉松弛缺陷26意荤。在非肌肉細(xì)胞中啊片，過(guò)表達(dá)卡爾德斯蒙會(huì)增加了肺癌A549細(xì)胞中應(yīng)力纖維的厚度，而通過(guò)RNAi去除卡爾德斯蒙會(huì)導(dǎo)致應(yīng)力纖維變薄27

過(guò)表達(dá)Caldesmon降低了SV80細(xì)胞的收縮性28玖像。這些表型是由于肌動(dòng)球蛋白束組織缺陷紫谷、肌動(dòng)球蛋白束收縮性增加、肌凝蛋白II鎖存狀態(tài)的喪失捐寥，還是由于肌動(dòng)球蛋白束的其他缺陷尚不清楚笤昨。卡爾德斯蒙表達(dá)水平的改變也與許多癌癥的進(jìn)展有關(guān)29握恳、30和發(fā)育異常25瞒窒、31-33，但其潛在機(jī)制尚不明確乡洼。

表明卡爾德蒙并不是肌凝蛋白II活性的負(fù)調(diào)控因子崇裁，而是交聯(lián)肌凝蛋白絲和肌動(dòng)球蛋白肌凝蛋白絲，以保持肌動(dòng)凝蛋白束內(nèi)肌凝蛋白II絲的規(guī)則間距

mCherry-卡爾德蒙沿收縮腹側(cè)應(yīng)力纖維和橫向弧呈現(xiàn)周期性定位模式束昵，但非收縮背側(cè)應(yīng)力纖維中沒有

發(fā)現(xiàn)卡爾德斯蒙是一種高度動(dòng)態(tài)的應(yīng)力纖維成分拔稳，中場(chǎng)休息時(shí)間約為1-2s。如之前報(bào)道的7,38锹雏，NM-IIA重鏈的恢復(fù)比Caldesmon要慢得多

3D-SIM分析顯示巴比，Caldesmon的n端區(qū)域定位于肌凝蛋白II的頸部區(qū)域。這是因?yàn)閙Cherry信號(hào)顯示了位于NM-IIA線圈-線圈信號(hào)兩側(cè)的兩個(gè)峰（圖2c和e）礁遵，但位于單個(gè)NM-IIA束中的兩個(gè)肌凝蛋白運(yùn)動(dòng)域信號(hào)峰之間（圖2d和f）

總之匿辩，這些結(jié)果揭示了卡爾德斯蒙是細(xì)胞中的一個(gè)擴(kuò)展分子。Caldesmon分別通過(guò)其n端區(qū)域和c端區(qū)域與肌凝蛋白II的頸部區(qū)域和tpm修飾的肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合

通過(guò)熒光肌動(dòng)蛋白和弩微模式生長(zhǎng)的長(zhǎng)春蛋白特異性抗體的局灶粘附顯示榛丢，敲除細(xì)胞中仍存在應(yīng)力纖維铲球，但與野生型U2OS細(xì)胞相比，應(yīng)力纖維網(wǎng)絡(luò)的組織不那么規(guī)律晰赞。敲除細(xì)胞的背側(cè)應(yīng)力纖維通常異常長(zhǎng)稼病，與細(xì)胞的前緣相比选侨，橫向弧線通常表現(xiàn)出“傾斜”的方向（圖3b和補(bǔ)充圖5a）

預(yù)計(jì)卡爾德斯蒙的消耗會(huì)導(dǎo)致應(yīng)力纖維的收縮性的增加。為了研究卡爾德蒙在應(yīng)力纖維收縮力中的作用然走，我們首先在野生型和卡爾德蒙敲除細(xì)胞上應(yīng)用了牽引力顯微鏡（TFM）

被鍍?cè)? kPa基質(zhì)上時(shí)援制，野生型和敲除細(xì)胞均表現(xiàn)出相似的，主要的細(xì)胞質(zhì)YAP定位芍瑞。然而晨仑，在50 kPa基質(zhì)上的細(xì)胞中，與Caldesmon敲除細(xì)胞相比拆檬，YAP在野生型細(xì)胞中顯示出更深刻的核定位（圖4e-g）

為了更詳細(xì)地了解卡爾德斯蒙的消耗如何影響單個(gè)應(yīng)力纖維的力學(xué)性能洪己，我們對(duì)野生型和卡爾德斯蒙敲除細(xì)胞的橫弧進(jìn)行了激光納米手術(shù)實(shí)驗(yàn)（圖5a-f）

根據(jù)我們之前的研究45-48，我們通過(guò)RFP-Lifeact的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)竟贯，觀察了野生型和卡爾德斯蒙敲除細(xì)胞中的應(yīng)力纖維答捕。為了使細(xì)胞的形狀和大小標(biāo)準(zhǔn)化，并誘導(dǎo)強(qiáng)烈的橫弧形成屑那，我們使用了弩形狀的單細(xì)胞微圖案玻璃覆蓋物來(lái)模擬極化細(xì)胞的形狀拱镐。然后，我們使用飛秒激光消融切斷選定的橫向弧持际，并將得到的與時(shí)間相關(guān)的縮回?cái)M合到開爾文-Voigt（KV）模型中沃琅，以獲得一個(gè)時(shí)間常數(shù)(τ)和平臺(tái)縮回距離（Lo）。在某些情況下蜘欲，弧收縮不符合KV收縮動(dòng)力學(xué)益眉，可能是因?yàn)榛〉膹澢螒B(tài)和KV模型假設(shè)的線性結(jié)構(gòu)之間的斷開。因此芒填，我們對(duì)
所有SFs進(jìn)行了第二次模型獨(dú)立的分析，其中我們測(cè)量了消融60秒后切割纖維一端縮回的距離（圖5b）在60 s時(shí)空繁，我們沒有觀察到τ殿衰、Lo或收縮的兩個(gè)細(xì)胞群之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異，這意味著卡爾德斯蒙并沒有顯著影響單個(gè)橫弧纖維的力學(xué)結(jié)構(gòu)

在研究腹側(cè)應(yīng)力纖維的力學(xué)機(jī)制時(shí)盛泡，為了提高細(xì)胞形狀和應(yīng)力纖維長(zhǎng)度的標(biāo)準(zhǔn)化闷祥，我們重新研究了矩形框架微模式的這些研究（補(bǔ)充圖6a-e）。在這里傲诵，在框架的一個(gè)邊緣引入了一個(gè)短的間隙凯砍，以促進(jìn)腹側(cè)的組裝

由于卡爾德斯蒙的缺失導(dǎo)致了應(yīng)力纖維網(wǎng)絡(luò)的異常組織，我們接下來(lái)分析了卡爾德斯蒙的缺失對(duì)肌凝蛋白II束的分布和動(dòng)力學(xué)的影響拴竹。重要的是悟衩，通過(guò)用抗NM-IIA重鏈抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，我們發(fā)現(xiàn)在纖維連接蛋白覆蓋的覆蓋物以及弩微模式上栓拜，肌凝蛋白絲和絲堆積的異常分布（圖6a座泳；補(bǔ)充圖7a）

在野生型細(xì)胞中惠昔，NM-IIA纖維沿著橫弧和腹側(cè)應(yīng)力纖維均勻分布，但卡爾德斯蒙敲除細(xì)胞的前沿顯示出NMIIA堆棧聚集在一起的區(qū)域挑势，而其他的橫弧區(qū)域完全沒有NM-IIA镇防。對(duì)圖像的盲分析顯示，~50%的敲除細(xì)胞沿著應(yīng)力纖維顯示出不規(guī)則的NM-IIA模式潮饱，而野生型細(xì)胞中相應(yīng)的數(shù)量為<5%（圖6b）

雖然NM-IIA纖維似乎在細(xì)胞邊緣正常組裝来氧，但它們通常沿著橫向弧表現(xiàn)出異常的橫向運(yùn)動(dòng)，并進(jìn)一步不平等地向相反的方向“拉”香拉。這些事件導(dǎo)致NM-IIA纖維絲在某些應(yīng)力纖維區(qū)域聚集啦扬，形成GFP-NM-IIA斑點(diǎn)團(tuán)塊，而其余應(yīng)力纖維區(qū)域缺乏NM-IIA纖維絲（圖6d缕溉；補(bǔ)充圖11a考传、b；補(bǔ)充影片8-10）

為了分析不同Caldesmon結(jié)構(gòu)域在調(diào)節(jié)NM-IIA分布中的作用证鸥，我們使用Caldesmon缺失結(jié)構(gòu)進(jìn)行了敲除-拯救實(shí)驗(yàn)（圖8a）僚楞。對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞上NM-IIA分布的盲法分析顯示，全長(zhǎng)mCherry-Caldesmon有效地挽救了敲除細(xì)胞中異常的肌凝蛋白分布枉层。相比之下泉褐，缺乏n端（肌球蛋白結(jié)合）區(qū)域的～并不能挽救表型，因?yàn)椤?0%的細(xì)胞表現(xiàn)出不規(guī)則的NM-IIA分布（圖8b）鸟蜡。請(qǐng)注意膜赃，這個(gè)值與從敲除細(xì)胞中定量的值相似（圖6b）。缺乏卡爾德smon中心區(qū)域[Cald（1-200/374-531）]的結(jié)構(gòu)在很大程度上挽救了肌凝蛋白表型揉忘，其中10%的_{細(xì)胞顯示出不規(guī)則的NM-IIA分布跳座。令人驚訝這個(gè)值與從敲除細(xì)胞中定量的值相似（圖6b）。缺乏卡爾德smon中心區(qū)域[Cald（1-200/374-531）]的結(jié)構(gòu)在很大程度上挽救了肌凝蛋白表型泣矛，其中10%的}細(xì)胞顯示出不規(guī)則的NM-IIA分布

然而疲眷，許多表達(dá)這種結(jié)構(gòu)的“拯救”細(xì)胞表現(xiàn)出另一種不尋常的肌凝蛋白表型，其中NM-IIA在很大程度上與應(yīng)力纖維分離您朽，并聚集在細(xì)胞的核周區(qū)域

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在野生型和卡爾德斯蒙敲除細(xì)胞中的應(yīng)力纖維力學(xué)狂丝。在弩模式上表達(dá)U20S野生型和卡爾德斯蒙寡聚物2KO細(xì)胞的RFP-LifeAct的單橫弧消融。上面一行是野生型哗总，下面一行是卡爾德斯蒙KO几颜。0s時(shí)的細(xì)胞表示消融前出現(xiàn)的SFs的分布，3s時(shí)的細(xì)胞表示消融后立即出現(xiàn)的SFs的分布讯屈。白色箭頭表示在成像開始后的3蛋哭、45和65 s，消融后應(yīng)力纖維收縮的增加涮母。比例尺= 10μm具壮。bSF收縮測(cè)量和與模型無(wú)關(guān)的SF收縮計(jì)算示意圖准颓。c隨時(shí)間跟蹤的SF收縮的例子」准耍縮回距離是t時(shí)刻被切斷端之間的半距離攘已。將SF的縮回與Kelvin-Voigt模型進(jìn)行擬合，提取出平臺(tái)的縮取出平臺(tái)的縮回距離（L0）怜跑、粘彈性常數(shù)(τ)和在光燒蝕過(guò)程中被破壞的SF的長(zhǎng)度（Da）（見“方法”部分）

野生型和Caldesmon KO U2OS細(xì)胞的獨(dú)立SF收縮分析样勃。WT和KO細(xì)胞應(yīng)力纖維一端消融后t = 60 s的收縮分布。這些數(shù)據(jù)代表了來(lái)自三個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)的n=28（野生型）和n=28（卡爾德斯蒙KO）細(xì)胞的平均值± SD性芬。差異不顯著（雙尾峡眶，非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)）。e野生型和Caldesmon KO U2OS細(xì)胞中切斷的SFs的粘彈性時(shí)間常數(shù)(τ)和f平臺(tái)收縮距離（Lo）植锉。來(lái)自面板e(cuò)和面板f的數(shù)據(jù)代表了來(lái)自三個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)的n=20（野生型）和n = 23（Caldesmon KO）細(xì)胞的平均值± SD辫樱。差異不顯著（雙尾，非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)）俊庇。非kv收縮被排除在(e)和(f)的數(shù)據(jù)集中狮暑。源數(shù)據(jù)作為源

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圖6|卡爾德斯蒙保持了肌凝蛋白II沿應(yīng)力纖維的規(guī)則分布。野生型和oligo2KO（虛線表示）U2OS細(xì)胞的典型例子辉饱，相互混合搬男，用Caldesmon抗體，NM-IIA螺旋螺旋彭沼，用菌素染色觀察f-肌動(dòng)蛋白缔逛。右邊的面板是左邊面板中白色盒子所示區(qū)域的放大圖，它們顯示了野生型細(xì)胞中沿著f-肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維（面板2）的NM-IIA（面板1）的規(guī)則模式姓惑。在Caldesmon敲除細(xì)胞中褐奴，NM-IIA絲和絲堆的分布不規(guī)則（圖3），而肌動(dòng)蛋白絲在沒有NM-IIA的應(yīng)力纖維區(qū)域也表現(xiàn)出均勻的分布（圖4）于毙。比例尺左圖20μm敦冬，放大圖像5μm。這些圖像代表了四個(gè)實(shí)驗(yàn)望众。b盲分析野生型和Caldesmon KO細(xì)胞的百分比匪补，顯示NM-IIA細(xì)絲的規(guī)則伞辛、中間和不規(guī)則分布烂翰。卡爾德斯蒙耗盡干擾了NM-IIA細(xì)絲的正態(tài)分布蚤氏。該數(shù)據(jù)代表了野生型（n = 193）和卡爾德斯蒙KO（n = 267）細(xì)胞從fp = 0.0433甘耿；**p = 0.0001；****p < 0.0001. c卡爾德斯蒙KO細(xì)胞的代表性圖像（虛線表示）竿滨，以及表達(dá)全長(zhǎng)mCherry-卡爾德斯蒙的敲除拯救細(xì)胞佳恬。細(xì)胞用抗NM-IIA螺旋抗體和法菌素染色捏境。放大圖像（右）顯示表達(dá)mCherry-Caldesmon的拯救細(xì)胞中NM-IIA絲分布規(guī)律（圖1），而未轉(zhuǎn)染的敲除細(xì)胞（圖2）顯示沿應(yīng)力纖維的NM-IIA分布不規(guī)則毁葱。比例尺垫言，15和5μm在整個(gè)細(xì)胞和放大圖像。d表達(dá)RFP-actin和GFP-NM-IIA的野生型和卡爾德斯蒙KO細(xì)胞的代表性延時(shí)蔡司空氣掃描圖像倾剿。左側(cè)虛線框所示區(qū)域的放大時(shí)間框架（右）顯示野生型細(xì)胞中NM-IIA堆棧沿橫向弧的規(guī)則向心流動(dòng)而Caldesmon敲除細(xì)胞中出現(xiàn)NM-IIA絲的異常橫向“滑動(dòng)”筷频。這導(dǎo)致NM-IIA在某些應(yīng)力纖維區(qū)域中（用白色括號(hào)表示）積累队伟，而其他應(yīng)力纖維區(qū)域中大部分缺乏NM-IIA懊悯。比例尺，5和1μ

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卡爾德斯蒙消耗對(duì)α-肌動(dòng)蛋白沿應(yīng)力纖維定位的影響烦磁。一個(gè)表達(dá)GFP-α-肌動(dòng)蛋白（綠色）和mCherry-卡爾德斯蒙（紅色）的野生型U2OS細(xì)胞（上一行）的代表性SIM圖像芹缔。白色的盒子表示放大的區(qū)域坯癣。放大圖像1‘和2’中的細(xì)黃色的線代表了用于ofα-肌動(dòng)蛋白/卡爾德斯蒙共定位的應(yīng)力纖維區(qū)域的例子。下面一行顯示了表達(dá)GFP-α-肌動(dòng)蛋白（綠色）的卡爾德斯蒙KO細(xì)胞的代表性SIM圖像最欠，并用磷鈣素對(duì)f-肌動(dòng)蛋白染色（紅色）示罗。放大的區(qū)域1、2和3代表了α-的定位
野生型U2OS細(xì)胞中α-肌動(dòng)蛋白共定位模式的線圖分析窒所。線掃描=平均來(lái)自3個(gè)細(xì)胞的n = 29絲的±掃描電鏡鹉勒。c-e對(duì)卡爾德蒙KO細(xì)胞中選定區(qū)域（1′、2′吵取、3′的黃線）的代表性線掃描顯示禽额，在應(yīng)激纖維內(nèi)α-肌動(dòng)蛋白豐富區(qū)域不規(guī)則分布。左皮官、中脯倒、右面板的比例尺分別為5、3和1 μm

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圖8卡爾德斯蒙及其不同結(jié)構(gòu)域在保持肌凝蛋白II絲在軌道上的|功能捺氢。轉(zhuǎn)染全長(zhǎng)卡爾德蒙藻丢、1-20ryCald（1-200）、201-531）和（1-200-374-531）構(gòu)建的卡爾德蒙寡核苷酸2KOU2OS細(xì)胞的典型例子摄乒。NM-IIA和F-actin分別通過(guò)抗NM-IIA螺旋抗體和菌素觀察悠反。虛線表示未轉(zhuǎn)染的卡爾德斯蒙KO細(xì)胞，而轉(zhuǎn)染卡爾德斯蒙的細(xì)胞可以通過(guò)mcherry表達(dá)來(lái)區(qū)分（第一行）馍佑。底部一行的放大圖像斋否，對(duì)應(yīng)于上面的白色虛線框，突出了NM-IIA細(xì)絲在各自細(xì)胞中的分布拭荤。比例尺茵臭，15μm和5μm和放大圖像。此外舅世，右圖顯示了一個(gè)表達(dá)mCherry-Cald（1-200）的核周并通過(guò)其c端結(jié)構(gòu)域與原肌凝蛋白-肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合旦委，將肌凝蛋白II與原肌凝蛋白修飾的肌動(dòng)蛋白絲連接起來(lái)奇徒。我們進(jìn)一步提出，肌凝蛋白II運(yùn)動(dòng)結(jié)構(gòu)域與Tpm4.2修飾的肌動(dòng)蛋白絲相關(guān)(參考文獻(xiàn)缨硝。而卡爾德斯mon更傾向于結(jié)合由其他非肌原肌凝蛋白亞型修飾的肌動(dòng)蛋白絲摩钙。dd在野生型細(xì)胞（左）中，肌凝蛋白II絲在橫向弧內(nèi)顯示有規(guī)則的間距查辩。在沒有Caldesmon（右）的情況下腺律，肌凝蛋白II絲沿著肌動(dòng)蛋白絲表現(xiàn)出異常的橫向滑動(dòng)，這導(dǎo)致了肌凝蛋白II絲在應(yīng)力纖維中的不規(guī)則分布宜肉。因此匀钧，應(yīng)力纖維網(wǎng)絡(luò)的組織和力的平衡受到干擾，這進(jìn)一步導(dǎo)致了細(xì)胞形態(tài)發(fā)生谬返、遷移之斯、侵襲和機(jī)械感應(yīng)的缺陷。源數(shù)據(jù)作為源數(shù)據(jù)文件提供遣铝。