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寫在前面
從10月底開始衣摩，由克里克學(xué)院與康昱盛主辦的蛋白質(zhì)組學(xué)網(wǎng)絡(luò)大課堂正式開班了荠瘪！整個課程由21堂大課組成贡蓖。作為蛋白質(zhì)組學(xué)純小白一枚纺酸，小編也打算借這個機會好好學(xué)習(xí)感受一下嘲碱。繼第一講“蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法概述”和第二講“蛋白質(zhì)譜實驗樣品前處理”之后金砍，小編再接再厲，整理了第三講“蛋白質(zhì)譜的原理及使用”的聽課筆記麦锯，分享給各位恕稠。
前面跟大家分享了質(zhì)譜儀的原理、性能參數(shù)扶欣，以及串聯(lián)質(zhì)譜儀的工作方式谱俭，錯過的小伙伴請戳：
聽課筆記之蛋白質(zhì)譜的原理及使用（一）
聽課筆記之蛋白質(zhì)譜的原理及使用（二）
聽課筆記之蛋白質(zhì)譜的原理及使用（三）
今天是第三講聽課筆記的最后一篇，小編要跟大家分享的是質(zhì)譜儀宵蛀、納升液相色譜和液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)的使用與維護昆著，以及如何對質(zhì)譜系統(tǒng)的運行狀態(tài)進行評估。
授課老師
這次課程的授課老師是來自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院的李溱老師术陶。李老師于1999年本科畢業(yè)于北京師范大學(xué)凑懂，2007年于美國德克薩斯州Texas A&M大學(xué)獲得博士學(xué)位，2008年-2009年在University of Illinois at Urbana-Champaign從事博士后研究梧宫。于2011年加入中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院接谨，任副教授，在植物生理學(xué)與生物化學(xué)國家重點實驗室及中國農(nóng)業(yè)大學(xué)“985”功能基因組中心生物質(zhì)譜實驗室工作塘匣，負責生物質(zhì)譜實驗室日常運行脓豪，對外提供蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)服務(wù)，并開展基于高分辨質(zhì)譜技術(shù)的植物代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究工作忌卤。李老師對各種質(zhì)譜儀器的原理扫夜、特點及運行維護有著非常豐富的理論積累和實踐經(jīng)驗，很有幸能邀請到他為我們介紹蛋白質(zhì)譜的原理和操作。
（文中所有圖片均來自李溱老師的講義笤闯，并獲得發(fā)表授權(quán)堕阔。）
本次課程的內(nèi)容分三大部分：
質(zhì)譜儀的原理、使用與維護
納升型液相色譜儀的使用與維護
生物質(zhì)譜運行狀態(tài)的評估
質(zhì)譜儀的使用與維護
之前我們講到了質(zhì)譜儀主要分為以下五個部分颗味，那么我們就分別針對這些部分來討論一下使用中可能遇到的問題超陆。
質(zhì)量分析器
包括mass analyzer和mass filter。對于質(zhì)量分析器的使用和維護浦马，主要有以下幾個要點：
1时呀、 對分辨率和質(zhì)量準確性進行校正。
這個怎么做呢晶默？最簡單的辦法就是谨娜，每天我們對數(shù)據(jù)采集中的背景信號進行評估。
比如我們發(fā)現(xiàn)荤胁，每天質(zhì)譜圖的背景噪音中445.12003處都有一個峰瞧预，這應(yīng)該是空氣中硅酮或者裝修材料導(dǎo)致的。通過評估這個峰的寬度和質(zhì)量準確度仅政，我們就能知道質(zhì)譜的質(zhì)量軸不是發(fā)生了漂移垢油。除此以外，還可以用質(zhì)量校正液對質(zhì)量準確性進行評估圆丹，這個根據(jù)質(zhì)譜儀的現(xiàn)狀滩愁，可以每天做，或者每周來做辫封。
2硝枉、 評估靈敏度
最簡單的辦法是做一個標準品，看看它的信號強度有多強倦微，通過這個來評估質(zhì)譜儀的靈敏度妻味。如果發(fā)現(xiàn)靈敏度變差了，我們就要考慮是否有污染欣福，或者某個參數(shù)設(shè)置錯誤责球。
3、 檢測質(zhì)量隔離的準確性以及離子傳輸/碎裂效率的評估拓劝。
這對QE質(zhì)譜儀來講雏逾，可能是更加明顯的問題。在質(zhì)譜儀做二級的時候郑临，我們是利用四級桿對母離子進行選擇栖博，如果質(zhì)譜儀的設(shè)置參數(shù)有問題，它對母離子的選擇就會發(fā)生偏差厢洞。比如我們想讓它選擇質(zhì)荷比為300的離子仇让，結(jié)果它選擇出來的是298的離子典奉，就會產(chǎn)生錯誤。
還有一個問題妹孙，質(zhì)譜儀不能把所有質(zhì)荷比為300的離子都選擇進來秋柄，在傳輸過程中會產(chǎn)生一些損失获枝。針對傳輸效率蠢正，我們需要通過一些實驗來分析。最簡單的辦法還是做一個標準品省店，通過標準品來看二級譜圖的質(zhì)量與之前運行得比較好的數(shù)據(jù)相比嚣崭，是不是變差了。如果變差則說明離子傳輸?shù)男士赡芟陆盗伺嘲托枰ㄟ^校正液等雹舀，對參數(shù)性能進行校正和評估。
比如QE粗俱，就有專門的校正和評估程序说榆，來檢測傳輸效率是不是發(fā)生了下降。如果下降了寸认，就需要清洗離子源签财、四級桿，或者傳輸系統(tǒng)偏塞，恢復(fù)它的性能唱蒸。
真空系統(tǒng)
1、 每天需要檢查初級真空和高真空的讀數(shù)
這個是非常重要的灸叼，最好每天檢查兩至三次神汹。質(zhì)譜儀中的大部分問題都是與真空系統(tǒng)有關(guān)的。
2古今、 每天檢查泵油液面屁魏、顏色和溫度。
為什么需要檢查泵油呢捉腥？下圖紅圈標記的地方是QE機械泵的一個窗口氓拼，可以用來檢查泵油的顏色和液面。窗口旁邊有兩條線但狭，分別是液面上限和下限披诗，停機狀態(tài)的時候泵油會高一些，顯示比上限的刻度多一點立磁，啟動起來以后液面會下降一些呈队。
如果泵油太多，泵會“打嗝”唱歧，從廢氣管排出多余的泵油宪摧；泵油太低的話粒竖，散熱會出現(xiàn)問題。所以需要保證泵油是在兩個窗口線之間的几于。
泵油的顏色是另外一個很關(guān)鍵的指標蕊苗，它能體現(xiàn)出泵油受污染的程度。新的泵油沿彭，比如現(xiàn)在常用的GS495合成泵油朽砰，未使用前是黃色的，隨著使用時間增長喉刘，它會慢慢變成褐色瞧柔。其它質(zhì)譜儀，可能會用到Inland19泵油睦裳，未使用前是完全無色透明的造锅，隨時使用時間的增長，它也會變成褐色廉邑。當泵油變成褐色以后哥蔚，實際上是在告訴我們，它的使用壽命到期了蛛蒙，應(yīng)該換掉了糙箍。換泵油的頻率通常是半年一次。
泵油的溫度也是重要的指標宇驾。泵在工作的時候倍靡，泵殼溫度在70℃左右，如果泵的溫度過低课舍，表示泵的負荷不足塌西，如果溫度過高，則很可能泵的某個部位發(fā)生了嚴重的磨擦或者摩損筝尾。有一定經(jīng)驗以后捡需，我們可以用手摸一摸泵殼，如果感覺有點燙手筹淫，那個溫度就是對的站辉，如果非常燙手，那可能泵已經(jīng)過熱運行了损姜。
3饰剥、 每周開震氣閥震氣15-30min
這個工作也很重要。如果不震氣摧阅，很可能會導(dǎo)致泵的早衰汰蓉。為什么會出這個問題呢？我們先來看下圖：左側(cè)整體圖中紅色框起來的地方就是泵的入口棒卷，右邊是它放大以后的照片顾孽。
泵的入口對著的就是ESI的噴針祝钢，噴針會以200nL/min的速度往泵里面噴乙腈和水，這些乙腈和水被泵抽走之后若厚，就會通過廢氣管進入到泵油中拦英，乙腈可以與泵油混溶，導(dǎo)致泵油越來越稀测秸，而水是不會與泵油混溶的疤估，只會與泵油產(chǎn)生一種“水火不相融”的效果，使泵油乳化乞封。這些很熱的水會在泵里面流動做裙，腐蝕鑄鐵的泵頭岗憋，導(dǎo)致泵頭的縫隙變大肃晚，但泵的工作效率下降∽懈辏可見关串，定期震氣是必須要做的重要工作。
那么震氣是怎么操作的呢监徘？機械泵上會有一個震氣閥晋修，震氣閥的目的是將新鮮的空氣從此處抽到泵里面去』丝空氣進入泵以后墓卦，會將泵油中的水蒸氣（或者說濕氣）帶走，通過廢氣管排出來户敬。水分排出來以后落剪，泵的腐蝕就會得到控制了。
另外尿庐，我們要知道忠怖，與泵油互融的乙腈是沒辦法除掉的，所以我們需要每半年換一次泵油抄瑟，來減少乙腈對泵油的污染凡泣。
4、 定期檢查漏油情況
泵漏油是經(jīng)常發(fā)生的皮假，尤其是使用超過五年以后鞋拟，漏油基本上是必然的。這個油會漏到哪兒去呢惹资？通常比較好的質(zhì)譜儀贺纲，比如QE，會有一個接油的盤子布轿。其實當我們看到盤子里有油的時候哮笆，油已經(jīng)漏了很久了来颤。所以我們應(yīng)該經(jīng)常趴下來看看油殼的底部是否有油滲出來，如果有稠肘，就應(yīng)該及時維修福铅，防止因為漏油過多，造成泵里缺油项阴，導(dǎo)致泵運行的質(zhì)量就會越來越差滑黔，最后機械泵就會被燒壞。
5环揽、 注意機械泵和渦輪泵運行噪聲的變化
這是一個很微妙的過程略荡。我們知道，新買來的機械歉胶，運行的時候噪音非常小汛兜，運行起來很安靜。隨著儀器的老化通今，它的聲音會逐漸變大粥谬。但如果運行過程中噪音突然變大，則表示泵出現(xiàn)了一些故障辫塌，這時就需要關(guān)注真空度或者其它一些參數(shù)漏策，看看泵的性能是否發(fā)生了變化。
尤其是渦輪泵臼氨，運行時如果出現(xiàn)了一個非常尖的類似哨音的噪音掺喻，就說明渦輪泵出現(xiàn)了一些故障，需要密切監(jiān)視渦輪泵運行的真空度或者其它參數(shù)储矩。如果發(fā)現(xiàn)了故障感耙，可以第一時間排除，而不要等整個泵都壞了再維修椰苟，那就很耗時間了抑月。所以泵噪音的變化，是一種快速的信號舆蝴，可以提醒我們注意監(jiān)視泵的運行情況谦絮，盡早排除故障或進行維修。
6洁仗、 檢查儀器運行日志（log）中記錄的運行參數(shù)
QE質(zhì)譜儀每15分鐘會自動記錄一次儀器的運行參數(shù)层皱，這個記錄我們可以每天或每周查看，如果發(fā)現(xiàn)里面的參數(shù)突然發(fā)生了大的波動或變化赠潦，則表明相關(guān)的設(shè)備可能發(fā)生了故障叫胖，特別是與渦輪泵有關(guān)的電壓、溫度或工作電流等她奥。
另一個我們常見的問題就是真空度報警瓮增。各個質(zhì)譜儀都有可能出現(xiàn)真空度過高或過低的問題怎棱。泵損壞了會直接導(dǎo)致真空度過高。另外绷跑，毛細管離子傳輸?shù)娜肟谑芰藫p傷拳恋，變大了，或者說沒有擰緊砸捏，導(dǎo)致漏氣谬运，也會導(dǎo)致真空度過高。反之垦藏，當毛細管被堵塞時梆暖，會導(dǎo)致真高度過低。（后面會舉一個例子掂骏，一只蚊子把毛細管出口堵住了轰驳，拿走蚊子以后真空度恢復(fù)正常。）
離子源和離子傳輸系統(tǒng)
1芭挽、 噴針的清洗
噴針的潔凈度對噴霧穩(wěn)定性的影響是很大的滑废。前面介紹過，噴針是非常細的袜爪，長度大概是3-5mm，針尖的內(nèi)徑和外徑不到10μm薛闪。樣品通過針尖噴出去的辛馆，因為這里有高壓，而且毛細管會有300℃的高溫豁延，如果樣品在針尖處殘留昙篙，我們?nèi)庋凼强床坏降模珪?dǎo)致噴針形成不了連續(xù)的噴霧诱咏，而是會形成斷斷續(xù)續(xù)的噴霧苔可，或者很小的液滴。如果出現(xiàn)這種情況袋狞，就表示噴針的針尖污染了焚辅。
如何清洗呢？通常是用甲醇苟鸯，也可以用異丙醇與水的混合溶液沖洗針尖同蜻，如果還是沒辦法把污染物洗下來，就只能換一個噴針了早处。質(zhì)譜儀通常用的是不銹鋼的噴針湾蔓，這種噴針非常軟，清洗的時候一定要小心砌梆，否則容易把噴針碰歪默责，就不能再繼續(xù)使用了贬循。
下圖是一個比較極端的例子，一只蚊子跑了進去桃序，把離子源出口堵住了甘有，還把針尖碰斷了。
2葡缰、 離子傳輸毛細管的清洗
傳輸毛細管其實就是從大氣壓到質(zhì)譜儀真空狀態(tài)的一個漸變亏掀。進入質(zhì)譜儀的所有樣品，離子泛释、空氣滤愕、溶劑分子，都要經(jīng)過它怜校，所以它很容易發(fā)生污染间影。另外，毛細管的潔凈度又會影響粗真空茄茁，如果毛細管很臟魂贬，真空度就會下降，還會導(dǎo)致靈敏度的降低裙顽。
通常情況下付燥，毛細管的溫度是很高的，我們需要把它冷卻以后愈犹，再拆掉清洗键科。
上圖紅色圈出來的就是毛細管的位置。拆掉以后的毛細管如下圖：
毛細管開口處的直徑通常不到1mm漩怎。將毛細管組裝上去以后勋颖，如下圖，紅色和橙色圓圈分別標記了毛細管的入口勋锤，以及它穿過質(zhì)譜儀的出口饭玲。離子通過毛細管，進入到S-Lens叁执。
3茄厘、S-Lens的清洗
S-Lens可以看作是離子源的一部分，功能是聚焦離子徒恋。它的結(jié)構(gòu)是由13片不同的鐵片組成蚕断，通過下面的橫截面圖，我們看到它的每個鐵片上有一個圓圈入挣，而且這13個圓圈的大小是不一樣的亿乳，靠左側(cè)的圈大一些，靠右側(cè)的小一些，離子是從左邊進來葛假，往右走的過程障陶。
當離子進入S-Lens以后，空氣中其它的污染物也容易一起帶進來聊训，開始經(jīng)過的是大圈抱究，通常不會堵在圈上融欧，再往后圈變小索守，空氣中的污染分子就容易打到這些小圈上壤玫，使S-Lens發(fā)生污染员寇。所以需要定期清洗。比如下圖中拆下來的這個鐵片高镐，中心的圈周圍那一片灰色的東西埠忘，就是污染物堆積而形成的立哑。
清洗的方法是使用1% Liqui-nox超聲清洗挂滓，這是一種非常好用的清洗液苦银。S-Lens的清潔度對靈敏度的影響是很大的，尤其是在做小分子的時候赶站，S-Lens的污染很可能會導(dǎo)致信號丟失幔虏。所以如果發(fā)現(xiàn)質(zhì)譜沒有信號出來，可以先清洗一下S-Lens看看贝椿。
氣體系統(tǒng)想括、計算機及供電系統(tǒng)
1、 氣體系統(tǒng)
質(zhì)譜儀在碰撞池里是需要充高純度的氮氣或者氦氣的团秽，這部分由供氣系統(tǒng)來完成主胧。一般情況下，我們要求4個9（即氣體的純度大于等于99.99%）的高純氮或者高純氦习勤，在保證純度的前提下，還要保證有一定的壓力焙格。
2图毕、 計算機
目前高分辨質(zhì)譜儀產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量是非常大的，一小時產(chǎn)生500M-1G的數(shù)據(jù)很常見眷唉，所以每天可能會產(chǎn)生20G數(shù)據(jù)予颤，一個月就有600G，硬盤很容易裝滿冬阳。所以我們一定要注意定期備份和刪除數(shù)據(jù)蛤虐，保證有足夠大的硬盤空間來存放我們的實驗數(shù)據(jù)。
3肝陪、 供電和空調(diào)系統(tǒng)
液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)需要一個穩(wěn)定的電源驳庭。如果供電系統(tǒng)不穩(wěn)定，會導(dǎo)致很多問題。比如饲常，電源不穩(wěn)定會引起零地電壓不穩(wěn)蹲堂，導(dǎo)致液相色譜不能給質(zhì)譜儀準確的開始信號，使得它們無法同步贝淤，最終導(dǎo)致液相色譜與質(zhì)譜的通訊發(fā)生錯誤柒竞。
另外，實驗室的溫度播聪、濕度和潔凈度朽基，對于保證質(zhì)譜儀在一個穩(wěn)定的環(huán)境中運行，也是非常重要的离陶。
散熱系統(tǒng)
最后稼虎，對質(zhì)譜儀的散熱系統(tǒng)也需要進行除塵處理。QE有一個通風口枕磁，用來往里抽空氣渡蜻，達到通風散熱的效果。通風口也可能被空氣污染物堵塞计济，導(dǎo)致散熱效率下降茸苇，所以需要定期清洗。
納升液相系統(tǒng)的使用與維護
上面介紹了質(zhì)譜儀在使用中的注意事項沦寂，接下來我們學(xué)習(xí)一下納升液相色譜的使用與維護学密。
流動相和洗針液
1、流動相：納升液相色譜有一個很大的特點传藏，就是它的流動相消耗量非常少腻暮。我們可以計算一下，它的流速是在0.2-0.3μL/min毯侦，所以一個小時只會消耗十幾微升的流動相哭靖，一天的用量也不會超過0.3mL的量。而一個溶劑瓶通常能裝30mL的溶液侈离，算下來可以用100天试幽。
但是我們卻不可能真正用到100天。因為流動相里的一些成分會揮發(fā)卦碾，比如乙腈铺坞、甲酸，而且水相可能會被污染洲胖，這些都會導(dǎo)致流動相變質(zhì)济榨。因此，我們需要嚴格注意并定期更換流動相绿映，來防止流動相的揮發(fā)和微生物的滋生擒滑。
我們見過一些比較極端的情況，把溶劑瓶里的流動相倒出來后，發(fā)現(xiàn)瓶身上會有一圈白道橘忱，這就是長時間不更換溶液赴魁，里面長了大量的微生物形成的，這些微生物的代謝物會嚴重污染樣品钝诚，造成分析結(jié)果很不準確颖御。
2、洗針液：在使用洗針液時凝颇，要確保樣品不被弱洗液洗脫潘拱，使用的強洗液要能徹底清洗進樣系統(tǒng)，防止殘留和交叉污染拧略。
進樣瓶
進樣瓶的材料很重要芦岂，要求對樣品的吸附很弱，所以通常使用塑料瓶垫蛆，它比玻璃瓶的吸附力更弱一些禽最。而且應(yīng)該選尖底的塑料瓶（比如像下圖這樣的），可以保證最后一點溶液也能被進樣器吸走袱饭。尖底瓶可以將最后殘留的溶液控制在4μL以內(nèi)川无。
另外就是對自動進樣器的溫度進行控制，通陈枪裕控制在8℃左右懦趋。可能你會問疹味，為什么不能控制在4℃呢仅叫？4℃的時候，空氣中的水分會在進樣器內(nèi)部凝結(jié)糙捺，造成進樣器結(jié)露诫咱，8℃就沒有這個問題。
這里需要特別注意的是洪灯，做納升液相色譜遂跟，通量是非常低的，往往一天只能出十幾個樣品婴渡，也就是說，雖然我們的自動進樣器是96位的凯亮，甚至更多边臼，可以容納很多樣品，但是并不等于自動進樣器可以當成冰箱來使用假消。如果你的樣品比較多柠并，在前處理完成后，都應(yīng)該放到冰箱里，而進樣器里只放一天能做的樣品數(shù)臼予，比如十幾個鸣戴。沒必要把更多的樣品都放到自動進樣器里，這樣可以緩解進樣器的負擔粘拾，也能避免樣品因為自動進樣器發(fā)生了故障或者溫度太高時產(chǎn)生降解窄锅。
系統(tǒng)壓力
系統(tǒng)壓力是非常重要的部分。我們先來看看下面的柱壓曲線圖：
柱壓曲線可以很直接地反映出液相色譜系統(tǒng)是否正常缰雇。有操作經(jīng)驗的小伙伴都知道入偷，液相色譜系統(tǒng)很容易發(fā)生堵塞，檢查到底是哪里堵了械哟，為什么會堵疏之，都是非常頭痛的事。那么暇咆，如何來及時發(fā)現(xiàn)色譜可能會出現(xiàn)的堵塞或者故障呢锋爪？這時候我們就可以好好利用柱壓曲線來分析了。
上圖中上面那條是正常情況下的曲線爸业，分為兩段其骄，第一段（最左側(cè)有兩次大的起伏那一段）叫traping。這段實際上就是保留樣品打到Trap柱上沃呢，用高水相（99%的水）和比較高的流速（2-5μL/min）來沖洗年栓，把樣品中的鹽和其它雜質(zhì)除掉，于是形成的這么一段壓力變化圖薄霜。
然后我們用0.2μL/min的速度開始跑梯度某抓，跑完梯度就產(chǎn)生后面那一段較長的曲線，我們會看到壓力會呈現(xiàn)出逐漸升高惰瓜，再快速降低否副，再升高的過程。
第一段traping區(qū)崎坊，產(chǎn)生了一小段平穩(wěn)的峰备禀，這表示樣品的鹽已經(jīng)被除掉了。而像下面那條曲線中的traping階段奈揍，峰型明顯不如第一張圖平穩(wěn)曲尸，出現(xiàn)了壓力升高的現(xiàn)象，這表明樣品中可能會有雜質(zhì)在trap過程中被流動相慢慢地帶到柱子里男翰，而且會留在柱子上另患，導(dǎo)致柱上局部地堵塞。這種情況下說明樣品前處理是有一些問題的蛾绎，樣品處理得不是很干凈昆箕。
如果像第二張圖中顯示的那樣鸦列，在traping階段出現(xiàn)了壓力變高的現(xiàn)象，則很可能樣品中的雜質(zhì)進入到了分析柱中鹏倘，把分析柱堵了薯嗤。這種情況下，在做完實驗后纤泵，可以用相對高濃度的乙腈徹底地沖洗色譜柱骆姐，把里面的雜質(zhì)沖洗干凈。
在第二段夕吻，壓力應(yīng)該是慢慢地升高诲锹，然后降低，再升高的涉馅。因為99%水相的時候归园，壓力是比較高的，而乙腈混合物中當水的濃度為80%-90%的時候稚矿，壓力會慢慢上升庸诱，之后，隨著乙腈濃度的升高晤揣，壓力會有下降的過程桥爽，最后再回到比較高的壓力水平。如果整個柱壓曲線符合以上的變化規(guī)律昧识，則說明整個過程是沒問題的钠四。但如果樣品壓力突然大幅度降低，表示管路的接頭可能發(fā)生了斷裂跪楞，這個也是需要特別我們留意的信號缀去。
色譜柱超壓和漏液
色譜柱如果壓力過大，就超壓報警甸祭。那么超壓產(chǎn)生的原因可能有哪些呢缕碎？
酶解以后沒有離心，或者膠沒有處理好池户，樣品顆劣酱疲或膠顆粒進來以后，將色譜柱堵塞校焦；
有雜質(zhì)把進樣六通閥損壞了赊抖，這些雜質(zhì)可能會從六通閥里被沖出來，堵住柱子寨典；
沒有裁剪整齊的石英毛細管熏迹。
說到石英毛細管的裁剪，這絕對是個技術(shù)活凝赛。我們知道注暗，做柱子的時候要用石英毛細管進行連接，而連接處是不能直接擰到色譜柱的接頭處的墓猎，需要通過一個套管捆昏，先把毛細管切了，再用套管來接毙沾。切割毛細管的工具通常是陶瓷片骗卜，切的過程中很容易產(chǎn)生一些碎片。而且毛細管的內(nèi)徑只有100μm多左胞，外徑也只有360μm寇仓，這么細的管子，切的時候需要內(nèi)管和外面包覆的聚合物層一起切烤宙，這種聚合物材料的包覆層也容易切出毛邊遍烦。這些毛邊和碎片，很容易進到色譜柱里躺枕，造成堵塞服猪。
這個問題怎么解決呢？我們需要升級一下裁剪工具拐云，比較建議大家使用下圖的毛細管切割器罢猪。價格有點貴，3000多人民幣叉瘩，但切出來的口是非常整齊的膳帕，如果經(jīng)常需要用的話，可以考慮買一個薇缅。用毛細管切割器可以很有效地解決毛邊的問題危彩。
除了超壓，另一個可能出現(xiàn)的問題就是漏液捅暴，這個我們該怎么檢查呢恬砂？常用的辦法是用pH試紙。因為我們使用的99%的水和0.1%的甲酸蓬痒，是酸性溶液泻骤，我們用pH試紙把整個管路接口檢查一遍，如果發(fā)現(xiàn)試紙變成紅顏色梧奢，則說明有漏液狱掂。
還有一個需要我們注意的問題，就是納升液相色譜的套管和接頭亲轨。我們先來看一張實物圖：
通常趋惨，液相色譜儀的管路都是1/16’的管路（即管路內(nèi)徑是1/16’英寸，大約1.6mm）惦蚊，而石英毛細管的外徑是360-380μm器虾，顯然它們是不兼容的讯嫂，也就是說，我們?nèi)绻苯訉⒚毠苎b到管路接頭處兆沙，會留有很大的縫隙欧芽，所以需要套管才能把兩者緊密地接上。在進行管路連接時葛圃，我們需要保證套管的前沿與毛細管的前沿是并齊的千扔，且是沒有縫隙的。一旦有縫隙库正，會形成一個叫“死體積”的空間曲楚，導(dǎo)致色譜峰的變化。
另外褥符，納升液相色譜中使用的三通接頭是1/32’的管路（直徑0.8mm）龙誊，與1/16’的管路也不兼容，所以還需要換一個1/32’的套管属瓣，再往上連接载迄。
液相色譜管路使用的接頭分兩種，一種是PEEK（聚醚醚酮）塑料接頭抡蛙，它能承受的最大壓力是5600 psi护昧，另一種是不銹鋼接頭，可以承受的最大壓力為10000 psi粗截，這兩種接頭承受的最大壓力是不一樣的惋耙。我們在設(shè)置液相色譜系統(tǒng)壓力時，需要考慮的是承受壓力最弱的那個環(huán)節(jié)熊昌。比如绽榛，當色譜系統(tǒng)的任何一個接頭使用了PEEK材料，則整個系統(tǒng)的壓力都不能超過5000 psi婿屹，否則當壓力過大時灭美，PEEK接頭處的套管就很容易從接頭處蹦開，導(dǎo)致漏液昂利。我們在設(shè)置色譜的系統(tǒng)壓力時届腐，一定要確認清楚所有接頭的類型。
液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)的檢查和保養(yǎng)
接下來我們來說說液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)該如何檢查和保養(yǎng)蜂奸。
每日檢查
1） 實驗室溫濕度：如果實驗室溫度過高犁苏，比較空調(diào)壞了，則應(yīng)該馬上停止實驗扩所，否則围详，質(zhì)譜儀很容易因為溫度過高而造成測量結(jié)果不準。比如Q-TOF祖屏，過熱了以后助赞，它的TOF管長度就會發(fā)生變化买羞，質(zhì)譜質(zhì)量軸就會飄掉，導(dǎo)致結(jié)果很不準確嫉拐。
2） 機械泵油面哩都、工作溫度和油殼滲漏
3） 系統(tǒng)真空度（粗真空和高真空）
4） 質(zhì)譜質(zhì)量軸：檢查我們常看的值是否發(fā)生變化婉徘，如果有變化，說明質(zhì)量軸已經(jīng)不準確了咐汞，應(yīng)該立刻停下實驗重新校正盖呼。
5）溶劑瓶沉淀檢查：晃動并觀察溶劑瓶下部是否有絮狀沉淀，如果有則說明流動相在溶劑瓶里至少存放了一周以上化撕，應(yīng)該立刻換掉几晤，甚至應(yīng)該把溶劑瓶的濾頭也換掉，因為濾頭里可能會有很多的微生物植阴，而導(dǎo)致樣品的交叉污染蟹瘾。
每周保養(yǎng)
1） 質(zhì)量軸校正：校正的頻率根據(jù)質(zhì)譜儀的不同而不同，例如QTOF掠手，校正的頻率可能需要更高一些憾朴，具體的頻率要參考儀器商提供的手冊說明。
2） 機械泵震氣
3） 離子傳輸毛細管清洗
4） 流動相喷鸽，洗針液更換
每月保養(yǎng)
1） 離子傳輸系統(tǒng)（S-Lens）的清洗
2） 離子傳輸性能評估和校正
3） 四級桿污染程度評估
半年保養(yǎng)
1） 更換機械泵泵油
2） 清洗四級桿
3） 色譜儀管路清洗：推薦一種“神仙水”众雷，沖洗所有的管路，每次用量為20-50mL做祝。它的配方是：水：甲醇：乙腈：乙醇 = 1：1：1：1
4） 色譜泵柱塞桿砾省，密封墊滲漏測試：測試泵是否可以承受標稱的壓力，例如標稱為10000 psi混槐，那我們可以驗證一下是否能做到编兄。再比如，假設(shè)我們的方法設(shè)定是5000 psi声登，那我們跑一下試試是否會漏液狠鸳，如果發(fā)現(xiàn)漏液，則說明該泵不能提供5000 psi的穩(wěn)定壓力捌刮，在此壓力上由于它會漏夜碰煌，則流動相的流速測定也是錯誤的了。
5） 儀器除塵
6） UPS放電
7） 空調(diào)系統(tǒng)檢修
如何評估質(zhì)譜的運行狀態(tài)
TIC圖的峰強和峰寬
質(zhì)譜系統(tǒng)的運行狀態(tài)我們可以通過TIC圖來判斷绅作。那么芦圾，什么是TIC圖？TIC（Total Ion Chromatography）就是總離子色譜圖俄认。經(jīng)色譜分離流出的組分不斷進入質(zhì)譜个少，質(zhì)譜連續(xù)掃描進行數(shù)據(jù)采集洪乍，每一次掃描得到一張質(zhì)譜圖，每一張質(zhì)譜圖都對應(yīng)唯一的一個時間點夜焦，將每一張質(zhì)譜圖中所有離子強度相加壳澳，得到一個總的離子流強度值，然后以離子強度為縱坐標茫经，時間為橫坐標巷波，把各個時間點上的總離子流強度繪制出來，就形成了TIC圖卸伞。
TIC圖長什么樣子抹镊？大伙兒來感受一下：
為了評估質(zhì)譜運行狀態(tài)，李溱老師實驗室通常是做一個BSA（牛血清白蛋白）的標準品荤傲，進樣50-100 fmol（對應(yīng)幾納克的BSA）垮耳。拿到TIC圖以后，我們可以先來看色譜峰的強度遂黍，峰強度與靈敏度有關(guān)终佛。完全清洗并安裝好的質(zhì)譜儀，峰的強度可以達到1E8-1E9雾家，如果我們做完后發(fā)現(xiàn)強度只有1E7铃彰，則說明質(zhì)譜的靈敏度有問題（這里需要先排除樣品的質(zhì)量有問題）。如果靈敏度是對的榜贴，則說明最基本的參數(shù)是沒問題的豌研。
對應(yīng)上面的圖，很明顯可以看到唬党，同樣是自制的trap柱鹃共，系統(tǒng)徹底清洗后的峰強度，要大于運行一段時間后的值驶拱。
接下來看色譜峰的寬度霜浴，峰寬度決定了色譜柱的性能。如果發(fā)現(xiàn)峰變得異常的寬蓝纲，比如下面這樣的圖阴孟，則說明色譜柱，尤其是trap柱的性能明顯下降税迷，這時候就需要更換trap柱了永丝。
我們回到第一張TIC圖，觀察一下會發(fā)現(xiàn)箭养，大部分情況下色譜圖里都會有一個污染峰（紅色圓圈標記）慕嚷。它是怎么來的呢？這就是我們用的EP管、槍頭等帶來的污染（就是傳說中的塑料峰）喝检。第一個圖嗅辣，由于徹底清洗了系統(tǒng)，所以污染峰是比較弱的挠说，當運行了一段時間后會發(fā)現(xiàn)澡谭，污染峰又變高了，表示樣品中的污染在Trap柱中慢慢地積累损俭。這時候可以用90%乙腈的沖洗液來把柱里的污染物洗掉蛙奖。
然后，我們再比較一下自制trap柱與商業(yè)trap柱的峰寬杆兵。第一個圖的峰寬外永，通常在0.5-1分鐘，當換成商業(yè)化的高端Trap柱（1.7μm粒徑填料）時拧咳，它的峰寬明顯要小很多，可以把峰寬控制在10秒左右囚灼。（這兩組對比實驗我們用的是用的是同一根分析柱骆膝。）可見，Trap柱的表現(xiàn)對色譜的性能有很大的影響灶体，當使用比較好的Trap柱時阅签，可以把峰寬控制得很窄。
另外我們需要評估的就是搜庫的結(jié)果蝎抽，結(jié)果的評分以及每條肽段被檢測到的次數(shù)政钟，可以反映出二級離子的碎裂效率。如果搜庫得到的肽段得分都比較低樟结，則說明二級離子的碎裂效率變差养交，這時需要考慮清洗色譜柱以及離子源設(shè)備等。
特別提示：導(dǎo)致色譜峰變寬的另一種可能瓢宦，是trap柱嚴重污染引起的碎连。這種情況下，我們會發(fā)現(xiàn)一個很神奇的現(xiàn)象驮履，就是搜庫結(jié)果的評分并不低鱼辙，有時候反倒會非常高！這是為什么呢玫镐？
我們可以來分析一下倒戏。色譜峰變寬，代表著出峰時間變長恐似。比如杜跷，原來在10秒-30秒可以出峰完的一個肽段，這時候可能需要2-3分鐘來出峰。也就是說葱椭，該肽段被檢測到的次數(shù)會增加好幾倍捂寿，于是搜庫軟件也會打出的得分也會變高。而這時候得分變高顯然并不代表柱效變高了孵运，反倒是柱效下降了秦陋。這是一個很有意思的現(xiàn)象。它提醒我們治笨，當察看搜庫結(jié)果的評分時驳概，一定要綜合地判斷，如果出現(xiàn)色譜峰變寬旷赖，即便評分很高顺又，也不代表是一個好的結(jié)果。
異常峰
有時候等孵，我們還會碰到TIC圖出現(xiàn)一些很奇怪的峰稚照。在展示不正常的峰之前，我們先來感受兩張正常TIC圖的畫風俯萌。
上面兩張TIC圖分別對應(yīng)的是一個復(fù)雜樣品和一個SDS-PAGE條帶的簡單樣品果录。復(fù)雜樣品中，我們可以檢測到1000多個蛋白咐熙，SDS-PAGE條帶對應(yīng)著幾十個蛋白弱恒。不同復(fù)雜度的樣品，譜圖的畫風也是不一樣的棋恼，通過譜圖返弹，我們對質(zhì)譜儀工作的狀態(tài)可以有一個了解。通常針對上千個蛋白爪飘，或者幾十種蛋白义起，我們能看到的正常的譜圖就是這樣。
但有時候悦施，我們會碰到一些很奇怪的TIC圖并扇，則可以判斷色譜或質(zhì)譜出了問題。比如下面的例子：
可以看到抡诞，第一張TIC圖在中間偏右的位置值戳，有一系列連續(xù)的有規(guī)律的出峰捌锭，這種說明樣品可能受到了PDMS或PEG聚合物的污染光坝。它的特點就是取视，在質(zhì)譜圖上可以看到有一系列質(zhì)量相差44、88或者74的污染峰顷窒。它們的來源通常是質(zhì)量比較差的EP管蛙吏。比如PDMS就是EP管的脫模劑源哩，在制造的時候會涂在模具上，生產(chǎn)好后如果沒有清洗干凈鸦做，就會隨著EP管進入樣品励烦。如果看到這樣的峰，我們就得檢查是不是EP管質(zhì)量不好泼诱，下次應(yīng)該更換質(zhì)量更好的EP管坛掠。
第二張圖是一個比較極端的例子，樣品可能受到除PEG或PDMS以外的物質(zhì)的污染治筒，產(chǎn)生了非常強的污染信號屉栓，這種污染對于質(zhì)譜來說是災(zāi)難性的，因為它的含量非常高耸袜，該信號強度相當于幾微克蛋白對應(yīng)的質(zhì)譜信號友多。而且對于納升液相色譜，所有的樣品都是通過噴針進入到毛細管和質(zhì)譜儀中的堤框，也就是說域滥，大量的污染也都進入到了毛細管和質(zhì)譜儀中了，這是非常麻煩的事情蜈抓，需要停機骗绕，做徹底地清洗。所以我們一定要使用質(zhì)量好的EP管以及來源可靠的試劑资昧。
超載
目前的質(zhì)譜儀，性能已經(jīng)非常好了荆忍，通常我們進樣500ng就可以獲得很好的鑒定結(jié)果格带，因此不需要盲目地大量地進樣，否則就會造成超載的問題刹枉。
比如上面第一張圖叽唱，是正常的進樣量，峰寬40秒左右微宝，下面一張圖則是盲目進樣導(dǎo)致峰非常寬棺亭，超過了5分鐘。
大量進樣到底會造成什么樣的問題呢蟋软？最直接的影響就是镶摘，容易污染離子源，而且在trap柱中不容易被徹底清洗干凈岳守，發(fā)生拖尾凄敢。也就是說，上一樣品在trap柱中的殘留會污染下一個進樣湿痢。要解決這個問題涝缝，我們又得把整個實驗停下來，非常徹底地清洗trap柱，耽誤大量的時間拒逮。所以對于現(xiàn)在高性能的質(zhì)譜儀來說罐氨，大家尤其不要盲目地增加進樣量，這不但不能提高蛋白的鑒定效率滩援，反而只會增加后續(xù)清洗的負擔栅隐。
質(zhì)譜信號丟失或不穩(wěn)定
最后，我們來聊一聊當質(zhì)譜沒有信號了狠怨，或者信號不穩(wěn)定的時候约啊，應(yīng)該怎么辦。通常佣赖，查找問題的順序和邏輯是這樣的：
首先我們要看有沒有背景信號恰矩，就是說會不會得到一個基線噪音。如果沒有基線噪音憎蛤，有可能質(zhì)譜儀系統(tǒng)外傅，讀不出任何數(shù)據(jù)了。下一步我們需要確認俩檬，當沒有基線噪音時萎胰，有沒有東西進入質(zhì)譜儀，或者有沒有東西從質(zhì)譜儀出來：
1） 確認離子源有沒有噴霧電壓棚辽，如果沒有噴霧電壓技竟，則說明噴霧停止了，沒有東西進入質(zhì)譜儀屈藐。如果有的話榔组，比如噴霧電壓設(shè)為2.0，而質(zhì)譜檢測到的電壓為1.96联逻，且還檢測到了電流搓扯，說明離子源還在工作，有離子進入質(zhì)譜儀包归。
2） 當確認了離子源還在正常工作以后锨推，接下來要排除的是質(zhì)譜儀數(shù)據(jù)傳輸故障，也就是說公壤，質(zhì)譜儀還在工作换可，能檢測到數(shù)據(jù)，只是無法傳輸出來厦幅。這時可以檢測一下質(zhì)譜儀背后的連接線是否正常連接锦担，有沒有出現(xiàn)斷開的情況。
3） 如果離子源和數(shù)據(jù)傳輸都正常慨削，則很可能是質(zhì)譜儀本身發(fā)生了故障洞渔。
4） 最后需要排除的可能是色譜柱發(fā)生了堵塞套媚，或者色譜停泵了，導(dǎo)致液相色譜不再傳送樣品進質(zhì)譜磁椒。這種時候堤瘤，即便有噴霧電壓，也有可能是質(zhì)譜儀受空氣中的污染而產(chǎn)生的電流浆熔。
以上就是沒有背景信號的情況下最可能發(fā)生故障的地方本辐，我們可以一一排查。
如果有基線噪音医增，卻沒有樣品的信號慎皱，則需要排除以下可能：
1） 放錯樣品瓶。放進色譜的樣品瓶里其實沒有樣品叶骨，或者樣品裝得太少了茫多，進樣針夠不著樣品。
2） Trap柱失效了忽刽。Trap柱是用來Trap蛋白的天揖，正常的操作流程是，先用99%的水把蛋白樣品打到Trap柱上去跪帝，然后再切換到分析柱上今膊，把蛋白樣品從Trap柱上洗下來。如果Trap柱失效了伞剑，它不能夠Trap蛋白斑唬，蛋白樣品就會被直接洗到廢液中去，這樣也會導(dǎo)致沒有質(zhì)譜信號黎泣。這種情況下我們需要更換Trap柱試試赖钞。
3） Trap柱切換閥的故障。這個切換閥決定了流出來的東西是進分析柱還是進廢液聘裁，如果閥出現(xiàn)了故障，造成樣品進不了分析柱弓千，而是一直都只能進入廢液衡便，于是也就沒有樣品可以進入質(zhì)譜了。
4） 漏液洋访。如果發(fā)生漏液镣陕，則進質(zhì)譜的信號會變?nèi)酰@種時候應(yīng)該檢測漏液情況姻政。
如果有信號呆抑，但信號不穩(wěn)定：
1） 系統(tǒng)漏液，導(dǎo)致流速變低汁展，使得信號不穩(wěn)定鹊碍。
2） 噴針污染厌殉，沒法噴出連續(xù)的氣霧，斷斷續(xù)續(xù)的侈咕，且會在針尖形成液滴公罕。這種時候質(zhì)譜信號就會很不穩(wěn)定。我們可以用甲醇或乙醇溶液把噴針沖洗干凈再試試耀销，如果還是解決不了楼眷，就需要換個新的噴針；
3） 往噴針上供電的接頭插得不牢固熊尉，也會導(dǎo)致噴霧不連續(xù)罐柳。這時可以檢查一下接頭上是否銹掉了，如果有狰住，把銹磨掉张吉，再插上試試。
第三講“蛋白質(zhì)譜的原理及使用”聽課筆記小編就全部分享完了转晰，非常感謝李溱老師精彩的授課芦拿，以及對聽課筆記細致的審閱修改！不知道讀完整篇的童鞋們查邢，是否有所收獲呢蔗崎？歡迎給我們留言，講講你的學(xué)習(xí)體會扰藕、問題或者建議缓苛！
誠征稿件
另外，現(xiàn)向廣大粉絲征集有關(guān)生物信息學(xué)方面的高質(zhì)量推文稿件邓深，無論是數(shù)據(jù)庫未桥、軟件工具、算法芥备，還是經(jīng)驗冬耿、感悟，只要你認為能夠幫助大家的萌壳，都可以發(fā)給我們亦镶。一經(jīng)錄用，稿費從優(yōu)哦袱瓮！有意向的小伙伴請在公眾號內(nèi)留言缤骨，小編會及時聯(lián)系你！
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