To destroy is easier than to create掌动，摧毀總比創(chuàng)造要簡(jiǎn)單插佛，這句話轉(zhuǎn)換到基因編輯上就是：knockout比knock in容易。因?yàn)閗nockout只要摧毀基因，而knockin則是要?jiǎng)?chuàng)造一個(gè)新的“基因”，這個(gè)新”基因“不僅僅正確表達(dá)蔬浙，還需要有相應(yīng)的功能。換言之贞远，knockout是non-specific畴博，而knockin則是specific。
對(duì)于干細(xì)胞蓝仲、懸浮細(xì)胞俱病、原代細(xì)胞以及靜息狀態(tài)的細(xì)胞而言，轉(zhuǎn)染已經(jīng)相當(dāng)困難袱结，基于轉(zhuǎn)染方式的knockout則是難上加難亮隙，而knockin則是上下左右為難。假如你的課題需要knockin一些特殊標(biāo)記垢夹，而且不止一次需要knockin一次溢吻，那么有沒(méi)有什么討巧的辦法既可以減輕工作量，又可以specific果元？今天我們就來(lái)講重組酶介導(dǎo)的盒式交換 （recombinase-mediated cassette exchange促王，RMCE），個(gè)人關(guān)于這個(gè)技術(shù)的描述是：換藥不換湯而晒。
本文的1蝇狼、2點(diǎn)是基因重組背景知識(shí)和gateway重組的介紹，如不需要倡怎，可直接跳到第3點(diǎn)迅耘，直達(dá)RMCE（寧可不看一二，也絕不能錯(cuò)過(guò)三）监署。
1. 基因重組recombination
在動(dòng)筆寫這篇文章RMCE之前颤专，突然發(fā)現(xiàn)目前我們用到的幾乎所有基因編輯手段，都是一種特定生物學(xué)過(guò)程的結(jié)果焦匈，那就是--重組（Recombination）血公。例如我們?cè)谇懊娴奈恼轮杏刑岬竭^(guò)HDR（Homology directed repair）介導(dǎo)的CRISPR-Cas9技術(shù)，就是依賴基因的同源重組缓熟，將供體片段替換到基因組中累魔；此外，在piggyBac文章中提到的基因轉(zhuǎn)座 （Transposition）*：DNA從某一位置移動(dòng)到基因組上另一位置够滑，也屬于基因重組的范疇垦写，并且是一種高度特異的基因重組。因此彰触，在我們了解RMCE之前梯投，需要加強(qiáng)一遍重組在我們基因編輯技術(shù)知識(shí)譜系的重要程度。
Recombination的分類
一類：自然發(fā)生的重組類型至少有以下四種：
（1）General or homologous recombination（常規(guī)/同源重組）：發(fā)生在序列非常相似的DNA分子之間，如二倍體生物中的同源染色體分蓖。同源重組是TELEN以及HDR介導(dǎo)的CRISPR-Cas9的基因編輯的基礎(chǔ)尔艇，由于這種方法需要供體包含有非常長(zhǎng)的同源臂，從而可以達(dá)到精準(zhǔn)的效果么鹤，但精準(zhǔn)度越高终娃，其成功率又隨之降低。
（2）Illegitimate or nonhomologous（不合理/非同源重組）：由于這種重組方法并不需要有長(zhǎng)同源序列蒸甜，看起來(lái)“不合理”棠耕， 所以被稱之為不合理（非法）重組。這種重組可造成隨機(jī)突變柠新，在科學(xué)研究中也有用到窍荧。
（3）Site-specific recombination（位點(diǎn)特異性重組）： 顧名思義，就是需要有特定的識(shí)別位點(diǎn)才能開(kāi)啟的重組方式恨憎，而這些特定的識(shí)別位點(diǎn)通常長(zhǎng)度在幾十bp左右蕊退，gateway recombination和今天我們要講的RMCE則屬于這種，由此可以想象一下RMCE也需要獨(dú)特的識(shí)別位點(diǎn)憔恳。
（4）Replicative recombination：可以看到復(fù)制性轉(zhuǎn)座屬于這種類型咕痛。
二類：人為改造/創(chuàng)造的重組類型：
（1）Plasmid Insertion Recombination（質(zhì)粒插入重組）：在體外使用核酸酶可對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切，使用連接酶可將質(zhì)粒和DNA片段重組連接喇嘱。其人為性不僅僅是因?yàn)檫@是體外實(shí)驗(yàn)，同時(shí)人類也可以使用PCR的方式合成出相應(yīng)的酶切位點(diǎn)塞栅，從而增加質(zhì)粒的可編輯性者铜，這對(duì)于大家來(lái)說(shuō)就是家常便飯。
（2） Gene Gun Recombination（基因槍重組）： 主要用于植物工程放椰，將包裹在金粒子上的DNA分子轟入活細(xì)胞中作烟，最后該DNA溶液就可并入細(xì)胞的基因組中。這是一種物理改變DNA傳遞方法砾医，同時(shí)基因傳遞的方法有以下幾個(gè)分類：
從基因槍的原理我們理解到拿撩，改變DNA的傳遞方法，也是一種人為的重組方式如蚜。因此上圖還將（3） Virus Replication Recombination（病毒復(fù)制重組）和（4）電轉(zhuǎn)等等重組方式展現(xiàn)出來(lái)压恒，這里就不再細(xì)說(shuō)。
2. Gateway recombination
2.1 Gateway 介紹
Gateway重組是常用質(zhì)粒元件置換方案错邦，主要用于將目的元件在不依賴于核酸酶的方式探赫，置換到想要的backbone上。前面說(shuō)到撬呢，CRISPR-Cas9是從噬菌體侵入細(xì)菌時(shí)細(xì)菌的抵抗得到啟發(fā)伦吠，而gateway重組也是一個(gè)向自然界學(xué)習(xí)的典型例子。λ噬菌體在整合因子（IFN，Int）的幫助下毛仪，將自身的attP位點(diǎn)和大腸桿菌的attB位點(diǎn)進(jìn)行位點(diǎn)特異性重組搁嗓，從而將自身的基因組整合到大腸桿菌中，此時(shí)attB & P產(chǎn)生兩個(gè)新位點(diǎn)：attL & R箱靴。因此人們從這上得到啟發(fā)腺逛，將att位點(diǎn)克隆到質(zhì)粒中，這樣就可以輕松置換兩質(zhì)粒的原件刨晴，從而達(dá)到“換藥不換湯”的目的屉来。
從上圖可知：
（1）att位點(diǎn)的相關(guān)特性。
（2）以右圖為例狈癞，現(xiàn)想要將左邊紫色骨架質(zhì)粒的CaMPARI原件置換到右邊黃色骨架質(zhì)粒上茄靠，由于兩個(gè)骨架質(zhì)粒有可以互相重組的attL1 & attL2位點(diǎn)。將兩種質(zhì)粒放在同一個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)中蝶桶，使用LR clonase慨绳，即可輕松將CaMPAR從紫色骨架轉(zhuǎn)移到黃色骨架上，從而得到一個(gè)新質(zhì)粒真竖。而ccdB是一個(gè)自殺基因脐雪，當(dāng)細(xì)胞被轉(zhuǎn)入帶有ccdB的質(zhì)粒后，大腸桿菌將不再生長(zhǎng)恢共，因此平板/培養(yǎng)基只剩下含有目標(biāo)質(zhì)粒的大腸桿菌战秋。attL1 & L2重組后形成attP1 & P2的新位點(diǎn)。
（3）這種元件置換的方法讨韭，歸根結(jié)底就在于供體和受體之間具有可重組的識(shí)別位點(diǎn)脂信，按照這樣的思路，人們可以將多種特殊的識(shí)別位點(diǎn)包裝為元件置換系統(tǒng)透硝。
2.2 Gateway recombination實(shí)戰(zhàn)
目的：給質(zhì)粒插入RFP標(biāo)簽
（1）挑選質(zhì)粒
供體質(zhì)粒：mRFP1Rab5 狰闪；
目標(biāo)質(zhì)粒：pDONR-P2r-P3
（2）使用snapGene完成模擬
3. Recombinase-mediated cassette exchange重組酶介導(dǎo)的盒式交換
3.1 如何做到換藥不換湯
終于回到開(kāi)頭，在knockin本身就很難的情況下濒生，課題設(shè)計(jì)還需要多個(gè)knockin埋泵。如何做到只knockin一次，后面的”knockin“全部由RMCE完成罪治。以上gateway recombination只是開(kāi)胃小菜丽声，gateway主要用于體外構(gòu)建載體，而RMCE則可在體內(nèi)達(dá)成元件轉(zhuǎn)換的作用觉义。上一節(jié)我們了解到元件置換的基本原理就是：需要特點(diǎn)識(shí)別位點(diǎn)+特定的重組酶恒序。活細(xì)胞及生物體內(nèi)用到的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)就是大名鼎鼎的Cre-loxP谁撼、Flp-FRT以及Dre-rox歧胁。以Cre-loxP系統(tǒng)為例:
看到上面的圖是不是感覺(jué)很混亂并不好記憶滋饲，為什么loxP方向相同是倒置，相反是敲除或者移位喊巍。很多文章會(huì)告訴上圖的內(nèi)容屠缭，但根本的原因是loxP相當(dāng)于影子分身，每個(gè)之間都可以互換崭参，而且換的時(shí)候要求完全一樣（影子分身能不一樣呵曹？）。
我們想象一下上圖deletion的狀況何暮，loxP-gene-loxP片段被Cre酶切除出來(lái)后可能出現(xiàn)的結(jié)果：
（1）左右兩個(gè)loxP由于還可以和切除位點(diǎn)互補(bǔ)重組奄喂，因此，切出來(lái)的loxP-gene-loxP片段再次被重組回去海洼，其結(jié)果就是跨新，切了跟沒(méi)切一樣。因此坏逢，再次印證了一句話域帐，切開(kāi)只是第一步，DNA repair才是決定結(jié)果的關(guān)鍵一步
（2）按道理左邊loxP被Cre切開(kāi)后是整，重組時(shí)應(yīng)該結(jié)合自己原來(lái)殘留的缺口肖揣，但正是因?yàn)殚L(zhǎng)得一樣，它認(rèn)錯(cuò)了浮入，把右邊loxp剩下的缺口給占用了龙优，導(dǎo)致gene-loxP片段被擠出基因組，此時(shí)就達(dá)到了敲除的效果事秀。
根據(jù)以上描述陋率，我們想知道，怎樣才能解決秽晚，切了相當(dāng)于沒(méi)切的問(wèn)題呢？
3.2 loxP位點(diǎn)的變異體
在gateway中我們學(xué)到筒愚，att位點(diǎn)可有多種變體赴蝇，同樣loxP位點(diǎn)也是，如下圖所示巢掺，不同loxP位點(diǎn)之間也有特定的重組方式和親和力 [2]句伶。可以看到：
（1）野生型loxP可以和包括自己在內(nèi)的所有l(wèi)oxP突變體進(jìn)行重組陆淀。
（2）大部分loxP變體只能和少數(shù)loxP變體進(jìn)行重組考余，例如：loxP66可以和loxP71、511等進(jìn)行重組轧苫，最后形成相應(yīng)的loxP位點(diǎn)楚堤。
（3）少部分loxP變體只能和自己進(jìn)行重組，例如lox2272，每一種loxP變體的出現(xiàn)身冬，都是在完善和擴(kuò)大Cre-loxP系統(tǒng)衅胀，使之可使用性更強(qiáng)、更廣酥筝。
3.3 RMCE舉例
目的：通過(guò)元件替換方式將細(xì)胞顏色熒光標(biāo)簽由綠色改為紅色
Case 1
可以看到：loxP66-GFP-loxP71元件在Cre重組酶的幫助下滚躯，被替換為loxP66-DsRed-loxP71，由此嘿歌，細(xì)胞的熒光顏色由紅色轉(zhuǎn)為綠色掸掏。但這個(gè)系統(tǒng)的效果看似并不那么好，只有少數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)為紅色宙帝，而大部分仍然是綠色的丧凤，而造成這個(gè)結(jié)果的原因是什么？歡迎留言給出自己的答案茄唐，下周我會(huì)將自己的解讀放上來(lái)息裸。
4. RMCE目前的使用情況
在TELEN、ZFN和CRISPR-Cas9技術(shù)的出現(xiàn)沪编，使得knockin所需的同源臂長(zhǎng)度從原來(lái)的十幾kb呼盆，縮小到1 kb以內(nèi)，大大降低了knockin的難度。然而即使是新技術(shù)的出現(xiàn)瘾腰，knockin仍然具有較大的難度肴甸，尤其是knockin的效率會(huì)隨著插入片段的長(zhǎng)度增加而降低，超過(guò)3kb的knockin難度大大增加腿时。個(gè)人小小整理RMCE使用情況如下：
（1）早期RMCE技術(shù)主要和慢病毒、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)結(jié)合：使用慢病毒或轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)（睡美人SB或piggyBac）將master載體整合到基因組中饭宾，構(gòu)建出master cell line批糟，之后在Cre重組酶的幫助下，將目標(biāo)序列置換到master line中看铆，從而一步得到新的細(xì)胞系徽鼎。慢病毒和轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)有高效的特點(diǎn)，但其機(jī)制是隨機(jī)整合弹惦，因此當(dāng)課題需要精確編輯時(shí)否淤，這種整合方式則無(wú)法被采用。
（2）使用TELEN棠隐、ZFN技術(shù)將master載體質(zhì)粒knockin到細(xì)胞中石抡，構(gòu)建master line，隨后的故事同上助泽。這個(gè)方案運(yùn)用了精準(zhǔn)敲入啰扛，因此難度增加不少嚎京，但系統(tǒng)成熟不少。有人可能會(huì)說(shuō)侠讯，knockin我不怕難挖藏，我可以一個(gè)一個(gè)的knockin，不需要使用RMCE系統(tǒng)厢漩。但需要考慮到同一個(gè)細(xì)胞系膜眠，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞系內(nèi)異質(zhì)性也會(huì)增加溜嗜。有些課題對(duì)基因背景的均勻性有著變態(tài)的需求宵膨，此時(shí)使用RMCE系統(tǒng)置換元件的方式，可以得到幾乎一致的基因背景炸宵，但knockin序列不同的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系辟躏，從而提供更均勻穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)背景。
（3）敲入短片段master載體土全，通過(guò)Cre將長(zhǎng)片段置換到master line中捎琐，完美避開(kāi)長(zhǎng)片段敲入極其困難的困境。
（4）對(duì)于基因編輯困難的細(xì)胞裹匙，能獲取一個(gè)master line瑞凑，會(huì)讓整個(gè)課題組的工具系統(tǒng)上升一個(gè)等級(jí)。做過(guò)knockin的人都知道這個(gè)過(guò)程的困難概页。以TELEN系統(tǒng)為例籽御，需要共轉(zhuǎn)至少3個(gè)質(zhì)粒：含有TELEN同源臂的+目的基因的載體，TELEN導(dǎo)航質(zhì)粒Left + Right惰匙。以干細(xì)胞為例技掏，轉(zhuǎn)染效率是1%，那么一百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞可獲得約1萬(wàn)個(gè)被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞项鬼，而被共轉(zhuǎn)的細(xì)胞則可能只有500個(gè)哑梳，這500個(gè)細(xì)胞中，真正被純合knockin的細(xì)胞可能只有幾個(gè)绘盟。按照傳統(tǒng)挑單克隆的方式鸠真，那么很有可能就是培養(yǎng)了100個(gè)單克隆細(xì)胞系，最后只有1個(gè)是真正需要的奥此，這個(gè)工作量想起來(lái)都讓人覺(jué)得害怕。不過(guò)一般使用藥物篩選方式雁比，可最后篩出抗藥生長(zhǎng)的單克隆團(tuán)稚虎，但分離出單克隆的步驟仍不可少。
RMCE可以提供更為均勻穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)背景偎捎，但其優(yōu)勢(shì)也限制了其應(yīng)用蠢终，因?yàn)閙aster line敲入的位點(diǎn)限制了后續(xù)的應(yīng)用序攘。例如master line敲入位置是AAVS1位點(diǎn)，而其實(shí)課題需要的多個(gè)knockin是在多個(gè)不同位點(diǎn)的寻拂。此時(shí)RMCE系統(tǒng)則起不到作用程奠。是的，RMCE是基因編輯技術(shù)的補(bǔ)充祭钉，不能要求其完成一切需求瞄沙，但有了它，我們能用的工具就更多了慌核。個(gè)人覺(jué)得距境，AAVS1 knockin的master line非常實(shí)用，可以輕松構(gòu)建熒光標(biāo)簽細(xì)胞系垮卓，同時(shí)更多的inducible細(xì)胞系也更容易獲取垫桂。單獨(dú)把RMCE拿出來(lái)講，它可能不夠出彩粟按，它只是一個(gè)默默的扳手诬滩，看起來(lái)不起眼，但在關(guān)鍵時(shí)刻灭将，還真香疼鸟。
Reference：
[1] Araki, Kimi, Masatake Araki, and Ken‐ichi Yamamura. "Site‐directed integration of the cre gene mediated by Cre recombinase using a combination of mutant lox sites." Nucleic acids research 30.19 (2002): e103-e103.
