越來越多的科研學(xué)者使用二代測序（Next-Generation Sequencing）進(jìn)行自己課題研究十兢，很多科研人員選擇將樣本直接寄送到二代測序科服公司進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。很多人可能并不了解文庫構(gòu)建的完整流程认烁，今天小編就給大家介紹幾種常見文庫構(gòu)建的流程。
一. DNA建庫流程：
DNA建庫的完整流程：
基因組DNA片段化：由于目前測序儀讀長有限督勺，如雙端各測150bp或75bp等蔬墩，可采用酶打斷和超聲打斷兩種方式，酶打斷操作更方便炊林，更節(jié)省時(shí)間姥卢，但目前酶打斷還有一定的偏好性卷要，超聲打斷還是主流打斷方式渣聚；
末端修復(fù)：打斷后的DNA末端會(huì)有粘性末端，需要進(jìn)一步補(bǔ)平成平末端僧叉；
加A：與接頭T互補(bǔ)配對奕枝，增加接頭連接效率；
加接頭：接頭是一段固定序列瓶堕，能夠與芯片配對發(fā)生成簇反應(yīng)隘道，可分為長接頭（index在接頭上，index區(qū)分不同文庫樣本）郎笆，短接頭（index通過PCR引入）谭梗；
磁珠純化：一般此步驟采取兩步磁珠純化，根據(jù)磁珠優(yōu)先吸附大片段原理宛蚓，通過使用不同體積磁珠激捏，第一步磁珠純化去除大片段，第二步磁珠純化去除小片段凄吏，從而得到合適片段長度文庫远舅；
PCR擴(kuò)增：通過接頭引物擴(kuò)增富集文庫；
磁珠純化：純化文庫痕钢；
文庫質(zhì)檢：一般先用Qubit進(jìn)行文庫定量图柏，然后使用2100儀器進(jìn)行文庫片段分析，通過qPCR進(jìn)行絕對定量任连，混樣上機(jī)蚤吹。
二、 mRNA建庫流程：
mRNA分離：mRNA的3’端有Poly A結(jié)構(gòu)随抠，利用Oligo dT磁珠將mRNA從總RNA中拉出來裁着。mRNA建庫對RNA質(zhì)量要求較高余佃，一般要求RIN值大于7，RNA發(fā)生降解會(huì)引起只能捕獲到mRNA 3’端信息跨算，5’端信息會(huì)發(fā)生丟失爆土；
mRNA片段化：一般使用Mg離子及高溫打斷，片段化長度與打斷時(shí)間相關(guān)诸蚕；
一鏈二鏈合成：將mRNA先反轉(zhuǎn)錄成cDNA步势，再進(jìn)行二鏈合成橙垢；
DNA建庫：后續(xù)步驟和DNA建庫步驟相同瓤的，只是不要打斷步驟。
三润脸、LncRNA建庫流程
LncRNA建庫流程與mRNA建庫整體流程類似漠魏，只是第一步mRNA純化改為rRNA去除倔矾，目前市面rRNA去除主要有四種方法：
- 磁珠連接探針去除：通過堿基互補(bǔ)配對原理，對于rRNA序列有依耐性柱锹，不同物種使用不同探針類型哪自；去除rRNA后后續(xù)建庫流程與；
- DNA探針去除法I：根據(jù)rRNA序列設(shè)計(jì)特異性DNA探針禁熏，將探針與總RNA混合后進(jìn)行退火延伸壤巷，rRNA會(huì)形成DNA/RNA雙連結(jié)構(gòu)，利用RNAase H降解嵌合鏈中RNA瞧毙，再用DNA酶降解DNA探針胧华，剩下mRNA及LncRNA建庫流程與mRNA建庫流程一致，此法也是基于rRNA序列宙彪，不同物種使用不同探針矩动；
- DNA探針去除法II：先用隨機(jī)引物進(jìn)行一鏈合成，按建庫流程構(gòu)建單鏈文庫释漆，特異性DNA探針能與rRNA單鏈文庫退貨延伸悲没，形成雙鏈結(jié)構(gòu)，在反向接頭上帶有特殊酶切位點(diǎn)灵汪，一旦形成雙鏈結(jié)構(gòu)檀训，酶切位點(diǎn)能夠被酶識別，將接頭切除享言，rRNA不帶有完整接頭峻凫，mRNA及LncRNA帶有完整接頭，通過接頭引物富集的即是mRNA及LncRNA信息览露，此法也基于rRNA序列荧琼，不同物種使用不同探針；
- 變形退火法去除rRNA：此法是目前最新研發(fā)出來的rRNA去除方法，不過目前市場用戶還不多命锄，效果還有待進(jìn)一步驗(yàn)證堰乔。先使用隨機(jī)引物進(jìn)行一鏈合成，然后進(jìn)行變性形成單鏈cDNA及單鏈RNA混合樣本脐恩，加入特殊化學(xué)成分镐侯，能識別rRNA，促進(jìn)rRNA與其對應(yīng)的cDNA退火驶冒，而LcnRNA及mRNA則不會(huì)與cDNA退火苟翻，加入酶mix消化雙鏈rRNA/cDNA，后面在進(jìn)行常規(guī)的建庫步驟骗污。此原理不基于RNA序列崇猫，沒有物種局限性。此原理還有待市場驗(yàn)證需忿，如果效果理想將是rRNA去除突破性技術(shù)诅炉，可能會(huì)取代前三類rRNA去除技術(shù)。
