背景：

TMB是指腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation burden）歪架，TMB已顯示出作為多種應(yīng)用的預(yù)測性生物標(biāo)志物的潛力，包括不同TMB水平與各種癌癥患者對免疫檢查點(diǎn)抑制劑(ICI)治療反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)八孝。比如在黑色素瘤（melanoma）和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer）悼沿。

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TMB通常由WGS或WES數(shù)據(jù)（120X-150X）中計(jì)算得到鳞芙，也有一些臨床研究顯示，TMB能夠通過幾百個感興趣的基因（300-500基因）而被估算出來（targeted panel-sequence方法）卫玖。

TMB是通過計(jì)算編碼區(qū)每百萬堿基（megabase）上的非同義突變（SNV和indels公你，插入和缺失的堿基數(shù)一般小于20bp）數(shù)量算出來的，它代表了腫瘤基因組的穩(wěn)定性和腫瘤微環(huán)境中的異質(zhì)性假瞬。

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基因組片段中的突變(紅色標(biāo)記)反映在它們通過轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)生的蛋白質(zhì)中陕靠。一些蛋白質(zhì)被分割成多肽迂尝，然后通過主要組織相容性復(fù)合體(mhc)在細(xì)胞膜表面作為抗原呈現(xiàn)。如果抗原積累了足夠多的突變剪芥，它們就可以結(jié)合并激活t細(xì)胞垄开，然后t細(xì)胞就可以啟動免疫介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。

科學(xué)家們假設(shè)高TMB與新抗原的數(shù)量增加有關(guān)税肪，新抗原是細(xì)胞顯示的腫瘤特異性標(biāo)記物溉躲。這些抗原的增加可能會導(dǎo)致免疫系統(tǒng)對癌細(xì)胞的檢測增加，并使細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞更加活躍益兄。T細(xì)胞的激活進(jìn)一步被癌細(xì)胞所顯示的免疫檢查點(diǎn)所調(diào)節(jié)锻梳，因此使用ICIs治療可以提高患者的生存率。

計(jì)算TMB净捅，你需要知道測序區(qū)域的總大幸煽荨（total size of the region sequenced）,如果是WES測序，需要知道exome 捕獲區(qū)域大小蛔六，和total mutations（snv和indel）

TMB的類型界定不是很統(tǒng)一神汹，一般有三類：TMB-high，TMB-medium古今，TMB-low。沒有一個固定的標(biāo)準(zhǔn)：比如F1CDx的方法：

TMB-high (≥20 mutations/Mb)滔以，TMB-medium (<20 mutations/Mb ≥10 mutations/Mb) and TMB-low (<10 mutations/Mb).

其他過濾條件為： 突變頻率大于5%捉腥，且tumor樣本中深度大于20X，normal 樣本中深度大于10X你画。

也有些研究計(jì)算的時候給了個權(quán)重：

total number of truncating mutations1.5 + total number of non-truncating mutations1.0.

truncating mutations 是指：nonsense, frame-shift deletion, frame-shift insertion, and splice-site

non-truncating mutations是指：missense, in-frame deletion, in-frame insertion, and nonstop.

Silent mutations被排除在外抵碟，因?yàn)樗鼪]有氨基酸的改變。

保守估計(jì)用非同義突變坏匪，但也有文章用了全部的somatic mutations拟逮。

沒有對錯，每個人似乎都有自己的計(jì)算方式适滓。光TMB的定義都有好多文章：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6353746/

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6510391/

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fonc.2019.01161/full

總的來說敦迄，TMB的計(jì)算受到5個方面的影響：

1. Tumor Cell Content and Sequencing Coverage

更高的腫瘤細(xì)胞含量和測序覆蓋率對TMB數(shù)據(jù)的質(zhì)量起著關(guān)鍵作用例如，與全外顯子組測序相比凭迹，靶向組可以進(jìn)行更深層次的測序罚屋，具有更高的靈敏度，即使在腫瘤細(xì)胞含量較低(定義為10%)的情況下也能表現(xiàn)良好與全外顯子組測序相比嗅绸，Targeted panels已被證明具有更大的覆蓋范圍例如脾猛，最近的一項(xiàng)研究在使用MSK-IMPACT panel時，在所有腫瘤樣本中達(dá)到了平均測序覆蓋率為744x鱼鸠，而WES在腫瘤序列中達(dá)到了平均目標(biāo)覆蓋率為232x

2. Tissue Preprocessing

通常猛拴，在福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)方案中羹铅，腫瘤組織被固定在福爾馬林中，以保持組織和細(xì)胞的形態(tài)雖然FFPE為長時間儲存組織提供了一種經(jīng)濟(jì)有效的方法愉昆，但必須考慮其對TMB計(jì)算的影響這種方法的一個局限性是职员，它誘導(dǎo)形成各種交聯(lián)，使DNA鏈以共價結(jié)合在一起撼唾，這可能導(dǎo)致胞嘧啶堿基脫氨胞嘧啶脫氨基是下一代測序中基線噪聲的主要原因廉邑，導(dǎo)致FFPE中最常見的序列偽影(C:G >T: A)。這可能會生成必須在下游流程中刪除的工件倒谷。

3. Sequencing Strategy

WES蛛蒙，WGS，targeted panel based

4. Bioinformatics Pipelie

在TMB的大多數(shù)計(jì)算中渤愁，同義變異體和生殖系變異體被過濾掉牵祟，因?yàn)樗鼈儾惶赡苤苯訁⑴c新抗原的產(chǎn)生。但在有些pipeline中仍然保留了同義突變抖格。對于計(jì)算germline突變诺苹，理想情況下，應(yīng)該對每個患者的匹配的非腫瘤樣本進(jìn)行測序雹拄。然而收奔，在臨床實(shí)踐中，這種匹配樣本的可用性可能因不同的機(jī)構(gòu)和不同的組織因素而異滓玖，數(shù)據(jù)的不可用可能會抑制對生殖系變異的過濾坪哄。在下游分析中對不同變異檢測和其他軟件的選擇也可能影響TMB的最終計(jì)算方式。TMB可以通過多尺度深度學(xué)習(xí)pipeline直接從組織病理圖像中計(jì)算出來势篡，避免了測序和call 變異的需要翩肌。

5. Cut-offs

不同的研究分配了不同的邊界來描述高TMB狀態(tài)和低TMB狀態(tài)。在肺部禁悠，超過18,000例肺癌病例的中位TMB為7.2個突變/Mb念祭，約12%的患者顯示超過20個突變/Mb。作者發(fā)現(xiàn)碍侦，腫瘤突變負(fù)荷大于或等于10個突變/Mb是聯(lián)合免疫療法的最佳受益臨界值然而粱坤，在其他癌癥類型中，高TMB狀態(tài)被歸類為20個突變/Mb瓷产。

用maftools得到突變信息：

Tumor_Sample_Barcode Frame_Shift_Del Frame_Shift_Ins In_Frame_Del In_Frame_Ins Missense_Mutation Nonsense_Mutation Nonstop_Mutation Splice_Site Translation_Start_Site total

有人說用GATK CallableLoci to get the exact number of bases.這個方法已經(jīng)不能用了比规。GATK4之后就可以用DepthOfCoverage統(tǒng)計(jì)每個region上的堿基信息。

TMB和mutational load的區(qū)別：

mutational load（突變負(fù)荷）更多的是一個群體遺傳學(xué)術(shù)語IIRC拦英，而TMB是專門指的是體細(xì)胞變異蜒什。

還有一些工具可以直接計(jì)算TMB：

varlociraptor https://varlociraptor.github.io/docs/estimating/

moat http://moat.gersteinlab.org/?ref=labworm#!page-usage

ecTMB https://www.nature.com/articles/s41598-020-61575-1

TMBleR https://acc-bioinfo.github.io/TMBleR/

TMB在不同的癌癥中：

不同癌癥類型的TMB值差異很大，因?yàn)轶w細(xì)胞突變的數(shù)量可以從每兆基因組的0.01到400個突變疤估。研究表明灾常，黑色素瘤霎冯、非小細(xì)胞肺癌和其他鱗狀癌的TMB水平依次最高，而白血病和兒童腫瘤的TMB水平最低钞瀑，而其他癌癥如乳房沈撞、腎臟和卵巢的TMB水平為中等。TMB在不同癌癥的不同亞型中也存在差異雕什。由于TMB在不同癌癥類型和亞型中的高變異性缠俺，定義不同的臨界值對于改善生存預(yù)測和更好的治療決定是很重要的。例如贷岸，F(xiàn)ernandez等人的研究表明壹士，在TCGA前列腺癌隊(duì)列中，TMB每megabase的突變范圍為0.03 - 14.13個(平均=1.23)偿警，而在TCGA膀胱癌數(shù)據(jù)中躏救，TMB每megabase的突變范圍為0.04-99.68個(平均=6.92)。最近的一項(xiàng)研究表明螟蒸，不同類型的癌癥需要不同的臨界值盒使，才能找到能夠從ICI治療中受益的患者。此外七嫌，理解腫瘤中通常存在不同的細(xì)胞簇少办，即腫瘤異質(zhì)性是至關(guān)重要的，這可以影響TMB诵原，從而影響對ICIs的反應(yīng)英妓。另一個影響TMB的因素是樣本來源是原發(fā)組織還是轉(zhuǎn)移組織大多數(shù)轉(zhuǎn)移性樣本已被證明是單克隆的(即腫瘤中只有一個細(xì)胞群)，而原發(fā)腫瘤通常由更多的細(xì)胞群組成皮假，具有更高的整體遺傳多樣性(更異質(zhì)性)科學(xué)家已經(jīng)表明，與原發(fā)腫瘤相比骂维，轉(zhuǎn)移性腫瘤通常有更高的TMB水平惹资，這可能是由于轉(zhuǎn)移性病變的單克隆性質(zhì)。

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reference：

Xu Z, Dai J, Wang D, et al. Assessment of tumor mutation burden calculation from gene panel sequencing data. Onco Targets Ther. 2019;12:3401-3409. Published 2019 May 6. doi:10.2147/OTT.S196638

Meléndez B, Van Campenhout C, Rorive S, Remmelink M, Salmon I, D'Haene N. Methods of measurement for tumor mutational burden in tumor tissue. Transl Lung Cancer Res. 2018;7(6):661-667. doi:10.21037/tlcr.2018.08.02

Chalmers, Z.R., Connelly, C.F., Fabrizio, D. et al. Analysis of 100,000 human cancer genomes reveals the landscape of tumor mutational burden. Genome Med 9, 34 (2017). https://doi.org/10.1186/s13073-017-0424-2