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第二代測(cè)序原理的詳細(xì)解析居灯！
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2005年，羅氏推出了第一款二代測(cè)序儀羅氏454资昧，生命科學(xué)開(kāi)始進(jìn)入高通量測(cè)序時(shí)代。后續(xù)隨著Illumina系列測(cè)序平臺(tái)的推出，極大降低了二代測(cè)序的價(jià)格，推動(dòng)了高通量測(cè)序在生命科學(xué)各個(gè)研究領(lǐng)域的普及德绿。目前，高通量測(cè)序已經(jīng)成為一種常規(guī)研究方法退渗，大量科研工作中均會(huì)用到移稳。然而，為什么二代測(cè)序能實(shí)現(xiàn)高通量氓辣？為什么二代測(cè)序讀長(zhǎng)如此之短秒裕？為什么reads末端測(cè)序質(zhì)量會(huì)降低？應(yīng)該如何選擇測(cè)序讀長(zhǎng)與打斷片段的長(zhǎng)度钞啸？想要回答這些問(wèn)題几蜻，都需要詳細(xì)了解二代測(cè)序的基本原理。本篇文章以典型的Illumina雙末端測(cè)序?yàn)槔逭叮敿?xì)解析二代測(cè)序的原理梭稚。
第二代測(cè)序（Next-generation sequencing，NGS）又稱(chēng)為高通量測(cè)序（High-throughput sequencing）絮吵，是基于PCR和基因芯片發(fā)展而來(lái)的DNA測(cè)序技術(shù)弧烤。我們都知道一代測(cè)序?yàn)楹铣山K止測(cè)序，而二代測(cè)序開(kāi)創(chuàng)性的引入了可逆終止末端蹬敲，從而實(shí)現(xiàn)邊合成邊測(cè)序（Sequencing by Synthesis）暇昂。二代測(cè)序在DNA復(fù)制過(guò)程中通過(guò)捕捉新添加的堿基所攜帶的特殊標(biāo)記（一般為熒光分子標(biāo)記）來(lái)確定DNA的序列莺戒，現(xiàn)有的技術(shù)平臺(tái)主要包括Roche的454 FLX、Illumina的Miseq/Hiseq等急波。由于在二代測(cè)序中从铲，單個(gè)DNA分子必須擴(kuò)增成由相同DNA組成的基因簇，然后進(jìn)行同步復(fù)制澄暮，來(lái)增強(qiáng)熒光信號(hào)強(qiáng)度從而讀出DNA序列名段；而隨著讀長(zhǎng)增長(zhǎng)，基因簇復(fù)制的協(xié)同性降低泣懊，導(dǎo)致堿基測(cè)序質(zhì)量下降伸辟，這嚴(yán)格限制了二代測(cè)序的讀長(zhǎng)（不超過(guò)500bp），因此馍刮，二代測(cè)序具有通量高信夫、讀長(zhǎng)短的特點(diǎn)。二代測(cè)序適合擴(kuò)增子測(cè)序（例如16S渠退、18S忙迁、ITS的可變區(qū)），而基因組碎乃、宏基因組DNA則需要使用鳥(niǎo)槍法（Shotgun method）打斷成小片段，測(cè)序完畢后再使用生物信息學(xué)方法進(jìn)行拼接惠奸。
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文庫(kù)構(gòu)建
文庫(kù)構(gòu)建即為測(cè)序片段添加接頭。無(wú)論是PCR產(chǎn)生的片段還是基因組鳥(niǎo)槍法打斷的片段都具有特異性（PCR中不同樣品反向引物插入了特異性的barcode佛南，因此兩端也是特異的）梗掰，兩端缺乏必要的引物因此混合DNA片段不能直接擴(kuò)增和測(cè)序。DNA片段需要加接頭修飾才能進(jìn)行上機(jī)測(cè)序嗅回，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為二代測(cè)序的文庫(kù)構(gòu)建及穗。下面我們以常用的試劑盒NEBNext?Ultra? II DNA Library Prep Kit for Illumina?為例闡述二代測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建的流程及其原理，具體如下所示：
①末端修飾绵载。目前很多PCR使用的高保真Pfu聚合酶產(chǎn)生的片段末端是平齊的（也即沒(méi)有不配對(duì)的堿基）埂陆；鳥(niǎo)槍法產(chǎn)生的片段則是隨機(jī)斷裂，其末端可能是平齊的也可能是不平的娃豹。因此焚虱，建庫(kù)第一步是使用Taq聚合酶補(bǔ)齊不平的末端，并在兩個(gè)末端添加突出的堿基A懂版，從而產(chǎn)生粘性末端（若使用Taq酶擴(kuò)增鹃栽，則無(wú)需末端修飾），產(chǎn)生粘性末端的片段可以添加接頭（Adaptor）躯畴。
②添加接頭民鼓。經(jīng)過(guò)末端修飾后的PCR片段末端具有突出的A尾薇芝，而接頭具有突出的T尾，可以使用連接酶將接頭添加到DNA片段兩端丰嘉。NEB的接頭為特殊的堿基U連接的環(huán)狀結(jié)構(gòu)（可以增強(qiáng)穩(wěn)定性）夯到，因此連接接頭后，還需要將堿基U刪除從而形成“Y”形接頭供嚎。這一步添加的接頭主要是為了后續(xù)PCR中作為引物擴(kuò)增繼續(xù)添加文庫(kù)index和與測(cè)序平臺(tái)互補(bǔ)的寡核苷酸序列（此外還作為測(cè)序引物Rd1 SP/Rd2 SP）黄娘，而之所以為“Y”型開(kāi)叉結(jié)構(gòu)，是因?yàn)槊恳欢私宇^是兩條不互補(bǔ)的序列（每一端都是Rd1 SP與Rd2 SP交錯(cuò)）克滴，因?yàn)檫B接酶沒(méi)有選擇性逼争，每個(gè)接頭都是只靠突出的T來(lái)與DNA連接，“Y”接頭保證了每條單序列兩端均為不同的測(cè)序引物劝赔，從而在后續(xù)PCR中可以連接不同的寡核苷酸序列（P5/P7）誓焦，具體流程見(jiàn)下圖。
③磁珠純化着帽。添加接頭后的文庫(kù)體系中含有聚合酶杂伟、連接酶等各種酶以及輔助物質(zhì)，接頭的添加也是過(guò)量的仍翰，而且由于末端的不穩(wěn)定性赫粥，容易形成自連片段，鳥(niǎo)槍法打斷的片段中也可能有大片段存在予借，所以需要特殊磁珠（AMPure XP Beads）純化來(lái)去除大片段以及各種雜質(zhì)越平，從而獲得成功添加接頭的文庫(kù)片段。其原理為磁珠可以通過(guò)氫鍵等作用力來(lái)吸附DNA片段灵迫，磁珠本身不具有片段大小選擇的能力秦叛，但其儲(chǔ)存的buffer里面含有20%的PEG 8000，PEG濃度越大則可以吸附的DNA片段越小瀑粥。因此磁珠純化的時(shí)候要根據(jù)文庫(kù)片段不同嚴(yán)格控制磁珠添加量（其實(shí)是PEG添加量）來(lái)實(shí)現(xiàn)片段選擇挣跋。
④PCR擴(kuò)增。添加了接頭的DNA片段狞换，可以使用與接頭互補(bǔ)的引物來(lái)擴(kuò)增避咆。這個(gè)過(guò)程非常重要，因?yàn)槟壳八衅纹鋬啥耸遣换パa(bǔ)的Y形結(jié)構(gòu)哀澈，不能直接進(jìn)行測(cè)序牌借；此外，片段還需要添加用于區(qū)分不同文庫(kù)的特異性index割按，以及與測(cè)序儀芯片互補(bǔ)的兩種寡核苷酸序列（P5/P7）膨报。
⑤第二次磁珠純化。PCR后需要將產(chǎn)物DNA片段與聚合酶等雜質(zhì)分離，因此再次進(jìn)行磁珠純化现柠，之后進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)院领，包括DNA濃度檢測(cè)、瓊脂糖凝膠電泳和片段長(zhǎng)度檢測(cè)够吩，完成建庫(kù)比然。
測(cè)序是以單鏈為單位的，建庫(kù)完成后的每條DNA的單鏈均一端連有測(cè)序引物Read1 Sequencing Primer（Rd1SP）和P5周循，另一端為Rd2 SP强法、Index（Barcode）和P7。Index用來(lái)區(qū)分不同的文庫(kù)湾笛，因?yàn)闇y(cè)序儀一個(gè)run產(chǎn)生數(shù)據(jù)量巨大饮怯，由于實(shí)際情況不同，一次上機(jī)常會(huì)進(jìn)行多個(gè)文庫(kù)測(cè)序嚎研，因此需要加上Index來(lái)區(qū)分蓖墅。
上機(jī)測(cè)序
Illumina測(cè)序技術(shù)為基于基因芯片的邊合成邊測(cè)序，整個(gè)平臺(tái)可解剖為三個(gè)系統(tǒng)：一溫度控制系統(tǒng)临扮，原理和普通PCR儀一樣论矾，來(lái)控制反應(yīng)的進(jìn)行；二酶控制系統(tǒng)杆勇，通過(guò)各種酶來(lái)控制DNA合成與剪切贪壳；三熒光信號(hào)收集系統(tǒng)，可以理解為分辨率極高的照相機(jī)蚜退。在Illumina測(cè)序平臺(tái)的流通池（Flow cell）表面寥袭，通過(guò)基因芯片技術(shù)交錯(cuò)固定了無(wú)數(shù)條分別文庫(kù)接頭中P5和P7互補(bǔ)的寡核苷酸鏈（即短核苷酸鏈），單鏈化的文庫(kù)DNA片段進(jìn)入流通池后关霸，可以與表面的寡核苷酸結(jié)合，從而進(jìn)入測(cè)序過(guò)程杰扫。測(cè)序具體流程如下：
①首先以寡核苷酸為引物队寇、文庫(kù)片段為模板進(jìn)行DNA復(fù)制（因?yàn)槲膸?kù)稀釋后濃度足夠低，可以認(rèn)為文庫(kù)片段均勻的結(jié)合在流通池表面章姓，每個(gè)片段結(jié)合的位置相距足夠遠(yuǎn)佳遣，這很重要，否則測(cè)序時(shí)會(huì)導(dǎo)致信號(hào)疊加而不能識(shí)別）凡伊。復(fù)制完成后解鏈零渐，將文庫(kù)片段洗去，留在流通池表面的為與文庫(kù)模板互補(bǔ)的DNA鏈系忙。
②因?yàn)閱捂淒NA另一端為不同的接頭序列诵盼，可以與相鄰的另一種寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合，之后進(jìn)行“橋”式擴(kuò)增（假如第一次結(jié)合的為P7，則復(fù)制完成洗脫模板后頂端可以與相鄰的P5互補(bǔ)結(jié)合形成“橋”风宁，并以P5為引物進(jìn)行復(fù)制洁墙，完成后再次解鏈并與相鄰不同種接頭結(jié)合來(lái)進(jìn)行復(fù)制，如此類(lèi)推）戒财。25-28個(gè)循環(huán)完成后热监，原來(lái)散布在表面的單核苷酸序列變成散布的DNA簇，這一步主要是為后續(xù)測(cè)序做準(zhǔn)備饮寞，因?yàn)闇y(cè)序時(shí)單分子產(chǎn)生的光信號(hào)很弱孝扛，難以檢測(cè)。
③“橋”式擴(kuò)增后一個(gè)DNA簇都是由最初的一個(gè)文庫(kù)模板復(fù)制而來(lái)幽崩，但是這時(shí)候P7上的序列與P5上的序列是分別從兩端開(kāi)始的苦始，測(cè)序要保證每個(gè)片段一致性（都是正向或都是反向），因此再次解鏈線性化歉铝，切割并洗去P5上的DNA鏈盈简，只留P7上的DNA單鏈。Illumina巧妙地利用了甲酰胺基嘧啶糖苷酶Fpg對(duì)8-氧鳥(niǎo)嘌呤糖苷8-oxo-G的選擇性切斷作用太示，在合成的引物鏈上加入了一個(gè)8-oxo-G柠贤，用Fpg處理，就把帶8-oxo-G基團(tuán)切掉类缤，并把DNA鏈切斷臼勉，留下一帶不完整糖基的磷酸基。這個(gè)磷酸基在接下來(lái)的過(guò)程中餐弱，起到了阻止P5延伸的作用宴霸。此后的雙末端測(cè)序中需要恢復(fù)3'-OH，則用脫嘌呤嘧啶內(nèi)切核酸酶AP-endonuclease把帶不完整糖基的那個(gè)磷酸基切掉膏蚓。
④加入測(cè)序引物Read1 SP和修飾過(guò)的DNA聚合酶瓢谢，則在測(cè)序引物3’端開(kāi)始DNA復(fù)制。在流通池加入可逆終止熒光dNTP驮瞧，其3'-OH被阻隔（糖基3'連接有疊氮基團(tuán)氓扛，在鏈延伸時(shí)起到了阻止添加下一個(gè)dNTP作用，因此在除去阻隔前只能添加一個(gè)堿基）论笔，4種dNTP在堿基上分別連接有不同顏色的熒光基團(tuán)（也可以相同顏色熒光標(biāo)記采郎，但是測(cè)序會(huì)更慢，每次只能添加一種堿基）狂魔。之后洗掉多余的dNTP蒜埋，使用激光掃描，收集留在流通池表面的熒光信號(hào)（如圖1-6所示）最楷。用巰基試劑去掉3’位阻斷的疊氮基團(tuán)整份，用TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine,三(2-羧乙基)膦)去掉熒光基團(tuán)待错，進(jìn)入下一個(gè)堿基的測(cè)序反應(yīng)。因?yàn)槊織lDNA單鏈擴(kuò)增形成的DNA簇均固定在表面皂林，隨著反應(yīng)進(jìn)行根據(jù)相同位置出現(xiàn)的熒光信號(hào)情況朗鸠，就逐漸讀出了改位點(diǎn)DNA鏈的序列。
⑤要保證測(cè)序的準(zhǔn)確性础倍，需要一個(gè)位點(diǎn)DNA簇的每條鏈同步復(fù)制烛占，然而隨著反應(yīng)進(jìn)行，不同鏈復(fù)制情況會(huì)出現(xiàn)差異沟启，因此二代測(cè)序讀長(zhǎng)目前限制在300bp以內(nèi)忆家。Read1結(jié)束后，解鏈并洗掉測(cè)序中已經(jīng)合成的部分德迹，加入測(cè)序引物Index引物（也即Read2 SP互補(bǔ)的寡核苷酸）芽卿，這時(shí)會(huì)繼續(xù)在3’端進(jìn)行復(fù)制，讀出接頭中Index序列胳搞，從而可以確定出每個(gè)位點(diǎn)的DNA屬于哪個(gè)文庫(kù)卸例。
⑥為了增長(zhǎng)測(cè)序長(zhǎng)度，進(jìn)行另一個(gè)方向測(cè)序肌毅，也即雙末端測(cè)序筷转。洗掉前面復(fù)制合成的片段，DNA單鏈繼續(xù)在流通池表面形成橋式連接悬而，這時(shí)要用脫嘌呤嘧啶內(nèi)切核酸酶處理修復(fù)P5的3’-OH末端呜舒，加入聚合酶，則在P5末端開(kāi)始DNA復(fù)制笨奠。十幾個(gè)循環(huán)后袭蝗，將P7上的DNA切割并洗掉。Illumina通過(guò)在P7核酸鏈中加入一個(gè)U堿基般婆，用USER酶（Uracil Specific Excision Reagent到腥，尿嘧啶鏈特定切斷試劑）來(lái)切隔斷鏈。這時(shí)只留下P5上的DNA鏈蔚袍，與Read中方向相反左电。加入測(cè)序引物Read2 SP，進(jìn)行另一端的序列讀取页响。
測(cè)序數(shù)據(jù)
一般我們接觸到的測(cè)序數(shù)據(jù)為fastq格式的堿基序列，然而早期Illumina平臺(tái)直接下機(jī)數(shù)據(jù)為bcl格式文件段誊，其儲(chǔ)存的是顯微拍攝得到的熒光信號(hào)信息闰蚕，如下所示（此圖為不同堿基使用相同熒光標(biāo)記的掃描結(jié)果）：
將相同區(qū)域不同時(shí)間拍攝的熒光圖片按照時(shí)間順序疊加處理，就可以獲得該位點(diǎn)結(jié)合的DNA序列的堿基順序连舍。
參考文獻(xiàn)
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編輯于 05-21
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吧啦吧啦09-13
您好盼玄，請(qǐng)問(wèn)能在解釋一下您講的“這一步添加的接頭主要是為了后續(xù)PCR中作為引物擴(kuò)增繼續(xù)添加文庫(kù)index和與測(cè)序平臺(tái)互補(bǔ)的寡核苷酸序列（此外還作為測(cè)序引物Rd1 SP/Rd2 SP）”贴彼，感覺(jué)不是很能理解，非常感謝埃儿！
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知乎用戶 (作者) 回復(fù)吧啦吧啦09-14知乎用戶
看這張圖器仗，最后PCR的結(jié)果是每個(gè)單鏈兩短都是不同的結(jié)合序列（分別是P7和P5），因此一開(kāi)始要添加Y接頭童番，Y接頭就是說(shuō)這段是不互補(bǔ)的精钮，分叉的（所以一開(kāi)始是弄成環(huán)狀增強(qiáng)穩(wěn)定性）。假如不是Y接頭剃斧，在后面的PCR中就不能保證每個(gè)單鏈兩端分別是P7和P5轨香，有可能會(huì)產(chǎn)生兩端都是P7或者兩端都是P5的序列，那樣就不能雙末端測(cè)序了幼东。
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吧啦吧啦回復(fù)知乎用戶 (作者)09-18
謝謝臂容！我明白了～
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