慢病毒可快速敷矫、高效的將目的基因整合到宿主細胞基因組，非常適合用于構建穩(wěn)轉細胞株榨汤。但慢病毒也有缺點怎茫，即使是穩(wěn)轉細胞株，可能會隨著傳代次數的增加而慢慢丟失干擾或者過表達的效率蜜宪。其中可能是原因是在多克隆穩(wěn)轉細胞系的培養(yǎng)過程中祥山，經慢病毒整合的細胞可能相對于野生型在生長活力沒有優(yōu)勢，因此隨著傳代次數的增加缝呕，經整合的陽性細胞數目慢慢變少，從而導致效率降低供常。在這種情況下可以選擇挑選單克隆穩(wěn)轉株的方式。
1. 轉座子
在幾乎所有的基因組中麻裁，基因組變異的一個主要原因是轉座因子（transposable element源祈，TE）或稱為轉座子（transposon）。轉座子是基因組中可以自由移動的分散的DNA序列新博，它們可以將自身從基因組的一個位置直接轉移到另外一個位置而不依賴于噬菌體或者質粒DNA等原件的幫助。依據轉座子的轉座機制原献，可分為以下兩種：
（1）逆轉座子（retrotransposon)：首先需要認識到馏慨，轉座子是存在于基因組DNA中的姑隅，它并不是外來物。因此基因組中的一類轉座子可以首先從基因組中轉錄出RNA慕趴，該RNA有類似逆轉錄病毒的作用鄙陡，該RNA通過逆轉錄的方法生成DNA，并整合到基因組中的新位點趁矾，這種方式類似于“復制--粘貼”。逆轉座子有LTR和non-LTR兩種详拙。
（2）DNA轉座子（DNA transposons）：顧名思義蔓同，是直接可以轉座的DNA片段，該片段由轉座酶催化而轉移斑粱，這意味著該轉座子應包含轉座酶識別的位點，另外轉座的位點可以是隨機的蹋宦，也可以是有特定位點的咒锻，這依賴于轉座酶是否有特異性識別的靶基因序列守屉，如果有則將轉座子片段特異的轉座到該位點，這就造成了跳躍的現象拇泛，因此轉座子也叫做跳躍基因。睡美人轉座子（sleeping beauty transposon）就是一類DNA轉座子恭取。這種方式類似于“剪切--粘貼”熄守。
而依據轉座的啟動方式耗跛，則又分為自主轉座子和非自主轉座子
（1）自主轉座子：自主即是不要依賴于其他因素的幫助攒发，可自發(fā)轉座的轉座事件。
（2）非自主轉座子：需要轉座酶惠猿、逆轉錄酶等其他因素幫助的轉座事件。
2. 轉座子結構
按照Class I和Class II的分類來看：
（1）作為逆轉座子系統(tǒng)的Class I姜凄，由于是“復制--粘貼”的模式趾访，因此逆轉座子的結構中一般包含RNA結合蛋白、逆轉錄酶等編碼序列屿聋，從而達到“自給自足藏鹊，逆風翻盤”的效果。
（2）作為Class II的DNA轉座子盘寡，由于是“剪切--粘貼”的模式，那么剪切需要轉座酶來實現脆粥，因此在DNA轉座子的兩端影涉，會有可供轉座酶識別和作用的位點，同時有一些DNA轉座子還帶有一些特殊的序列用以識別特定的基因組位點蟹倾，從而定向轉座。
3. 慢病毒與轉座子系統(tǒng)的對比
轉座子的優(yōu)點：操作簡單肌厨，可承載的基因片段大豁陆，無需包裝慢病毒，“后悔”插入還可以刪除盒音，全身而退馅而，一般用于刪除抗性基因/熒光標簽进胯，避免和后續(xù)慢病毒等基因編輯工具在篩選標記上有沖突。
轉座子的缺點：轉染效率低會影響整合效率偎血，質粒設計比較復雜（大約是因為我不會）盯漂，異染色質化會沉默基因表達，此時需要加入絕緣子帖渠。
4. 轉座子系統(tǒng)學習案例：piggyBac插入iCRISPR-Cas9系統(tǒng)
從上面第2點轉座子結構中我們可以看到竭宰，DNA轉座子系統(tǒng)的成員是最多的，包括大名鼎鼎的睡美人轉座子（sleeping beauty transposon切揭，SB）：
關于SB轉座子的發(fā)現，這中間還有一個美麗的故事哼审≡斜科學家們猶如王子，喚醒了鮭魚中已經失活了千萬年的轉座子系統(tǒng)励背，而在這個過程中，生物信息學分析方法起到了關鍵的作用终畅。在1997年竟闪，Ivics等人通過生物信息學分析方法杖狼，找到了鮭魚轉座子的保守序列，從而確定了已經滅絕的鮭魚中具有活性的睡美人轉座酶的基因序列蝶涩，隨后對這個古老的轉座子進行了分子水平的重建絮识，最終成功喚醒了沉睡千萬年的轉座子活性嗽上，因而得名睡美人。
而今天我們要講的是一個新的人工修飾的轉座子系統(tǒng)：piggyBac
piggyBac轉座子最初于1983年在飛蛾體內發(fā)現彼念，但直到2005年才成功用于哺乳動物細胞的基因編輯浅萧，它的特點有如下：
（1）作為經修飾后的DNA轉座子，piggyBac有兩個組成部分洼畅，轉座子和轉座酶；（2）piggyBac轉座酶促進轉座子的基因組整合徘郭，尤其喜好基因組的TTAA位點丧肴；
（3）轉座酶也能以完全無縫的方式切除轉座子，不留下任何序列或突變闪湾；
（4）piggyBac具有較大的載貨能力(已證明超過200 kb)，并且沒有已知的上限江醇。
piggyBac質粒學習
這是我從Addgene上找到的一張piggBac的質粒圖譜：
（1）紅色箭頭所指向的兩個橙色小元件是piggyBac的末端重復序列（IR）何暇，這個序列可被轉座酶識別并且切割，同樣這個序列會傾向于轉座至基因組的TTAA位點条辟；
（2）可以看到左右兩個IR之間有新霉素和卡那霉素抗性基因（NeoR/KanR）宏胯，可用于作為篩選標記。隨后CMV肩袍、T7啟動子后面接著的增強型綠色熒光蛋白（EGFP）也可以作為篩選標記；
（3）除第（2）描述的元件外魂爪，我們不難看到在NeoR/KanR兩側有l(wèi)oxP標記，因此在轉座子整合成功后滓侍，還可以使用Cre將抗生素篩選標記切除，以免與后續(xù)基因編輯沖突捺球。需要注意的是使用Cre后浇衬，基因組中會留下一個loxP位點，這將改變內源性DNA序列耘擂，從而導致細胞毒性；
（4）需要注意piggyBac被整合到基因組之后秩霍，該轉座子的IR序列還能被轉座酶識別蚁阳，從而完全無縫的切除piggyBac轉座子。
下圖則展示了piggyBac從插入到被刪除的過程
5. piggyBac系統(tǒng)的注意事項
下面根據所查到的資料以及個人使用經驗颠悬，羅列自己能想到的使用注意事項：
（1）piggyBac的投遞方式是質粒轉染定血，因此細胞的被轉染效率非常重要；
（2）使用piggyBac時澜沟，基因被完整地插入基因組，而使用標準的DNA質粒轉染時刊苍，被插入基因可能出現雙鏈斷裂濒析；
（3）可以通過提高轉座酶與轉座子的比率提高轉座子的整合率；
（4）應用piggyBac構建過表達細胞系的時候需要注意基因過表達不是越高越好号杏，過高的蛋白表達可能導致細胞死亡，因此轉座酶與轉座子的比率還需要使用者根據實際情況決定莹妒；
（5）piggyBac傾向于整合到染色質開發(fā)區(qū)域绰上，例如啟動子和外顯子區(qū)域，如果細胞的染色質結構經歷了重大的重排（如當干細胞開始分化）蜈块，任何整合的轉基因一樣，可能會發(fā)生轉基因沉默爽哎。因此建議在分化過程中保留篩選標記器一，同時還可以使用PCR跟蹤整合效率；
（6）piggyBac可以和其他基因編輯手段結合祈秕，如CRISPR/Cas9、TALENs和ZFNs等志鞍，使得基因編輯更加靈活方仿。例如和CRISPR/Cas9結合時，piggyBac可作為一個HDR模板被整合到基因組中仙蚜，而后期還可使用轉座酶移除；
（7）piggyBac加載的片段太大時黍翎，有可能使ITR的核酸酶位點被破壞艳丛，從而防止再次切割。
最近在師兄DZ的指導下碰酝，將iCRSPR作為轉座子插入序列戴差，例用piggyBac系統(tǒng)整合到基因組中，成功得到了inducible的CRISPR系統(tǒng)，這讓我一掃之前做IKO系統(tǒng)失敗的陰霾墨吓。piggyBac系統(tǒng)的使用纹磺，拓寬了我對基因編輯技術的認知，我仿佛像一個饑腸轆轆的人橄杨，發(fā)現一扇大門的門縫式矫，驚覺這門外有很多已經創(chuàng)造了數年且我從沒見過的食物。這技術爆炸的時代采转，我們不斷的感嘆自己的何其有幸，又不斷懊惱時間的如此有限锄列。個人的力量極其微弱惯悠，謹以此小小一文，希望能收獲大家的經驗之談克婶，我總是從你們身上學到許多，感謝鸭蛙。
