2019年9月，北京林業(yè)大學(xué)和藍(lán)景科信合作糜芳，在植物學(xué)主流學(xué)術(shù)期刊Journal of Experimental Botany上（IF=5.36）飒货，發(fā)表了題為“Populus euphratica?WRKY1 binds the promoter of H+-ATPase gene to enhance gene expression and salt tolerance”的研究成果。該研究借助DNA親和純化測(cè)序（DNA Affinity Purification Sequencing峭竣，DAP-seq）技術(shù)塘辅，深入揭示了胡楊耐鹽的分子機(jī)制。
研究背景
胡楊（Populus euphratica?Oliv.）是西北鹽堿荒漠地區(qū)皆撩，能夠形成森林優(yōu)勢(shì)的高大喬木扣墩，是研究木本植物耐鹽分子和生理機(jī)制的模式樹種哲银。但是胡楊的基因組相對(duì)復(fù)雜，高度雜合呻惕；而且荆责，胡楊不容易建立遺傳轉(zhuǎn)化體系，研究難度大亚脆，亟需使用創(chuàng)新技術(shù)研究胡楊耐鹽的分子機(jī)制做院。
胡楊的耐鹽性高于其它種類的楊樹，鹽脅迫下濒持，胡楊將Na+和Cl－區(qū)隔化到細(xì)胞的液泡中键耕，限制NaCl向木質(zhì)部導(dǎo)管的裝載。胡楊能促進(jìn)Na+的外排柑营、減少K+流失屈雄，維持離子平衡以降低鹽害。胡楊在長(zhǎng)期鹽脅迫下由境，能夠保持質(zhì)膜H+-ATPase的活性棚亩，從而具有較強(qiáng)的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)能力。然而虏杰，胡楊質(zhì)膜H+-ATPase的轉(zhuǎn)錄與酶活調(diào)節(jié)機(jī)制并不清楚讥蟆。本研究借助DAP-seq技術(shù)，深入研究了PeWRKY1通過調(diào)控質(zhì)膜H+-ATPasePeHA1的表達(dá)纺阔，參與胡楊耐鹽性形成的過程瘸彤。
研究成果
圖1.?使用DAP-seq技術(shù)獲得PeWRKY1結(jié)合的motif。
圖2. 使用酵母單雜交技術(shù)驗(yàn)證PeWRKY1與PeHA1啟動(dòng)子的互作笛钝。
圖3. 使用凝膠阻滯技術(shù)（Electrophoretic Mobility Shift Assay,?EMSA）驗(yàn)證PeWRKY1與PeHA1啟動(dòng)子中W-box的相互作用质况。
圖4. 使用熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)驗(yàn)證PeWRKY1與PeHA1啟動(dòng)子的互作。
研究結(jié)論
本研究使用DAP-seq技術(shù)玻靡，在基因組水平上结榄，鑒定了PeWRKY1轉(zhuǎn)錄因子與胡楊基因組DNA的結(jié)合位點(diǎn)信息，并通過酵母單雜交囤捻、EMSA臼朗、熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)驗(yàn)證了這一結(jié)果。鹽脅迫促進(jìn)了PeWRKY1與PeHA1啟動(dòng)子區(qū)W-box的結(jié)合蝎土，從而提高了PeHA1的表達(dá)视哑。PeWRKY1與PeHA1的相互作用，有助于增加質(zhì)膜H+-ATPase的活性誊涯、促進(jìn)Na+的排出挡毅，使胡楊在鹽脅迫下保持離子平衡。
關(guān)于DAP-seq
在基因組水平上暴构，鑒定轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)（transcription factor binding sites, TFBS）非常重要跪呈。ChIP-seq是進(jìn)行體內(nèi)檢測(cè)TFBS的主要方法段磨。然而，ChIP-seq依賴于抗體質(zhì)量庆械，這對(duì)低表達(dá)的蛋白質(zhì)具有很大的挑戰(zhàn)性薇溃。所以菌赖，ChIP-seq通常在規(guī)模上受到限制缭乘，難以進(jìn)行高通量擴(kuò)展。因此琉用，只有少數(shù)轉(zhuǎn)錄因子可以獲得結(jié)合位點(diǎn)信息堕绩，大量TFBS的覆蓋范圍只適用于人類和一些模式生物。
DAP-seq具有與ChIP-seq同樣的功能邑时，通過體外蛋白表達(dá)技術(shù)奴紧，表達(dá)出帶有標(biāo)簽的轉(zhuǎn)錄因子，和基因組DNA文庫(kù)在體外進(jìn)行結(jié)合晶丘，然后分離出與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA黍氮，再使用高通量測(cè)序，找到轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)浅浮。
DAP-seq的優(yōu)勢(shì)
與ChIP-seq相比沫浆，DAP-seq不需要針對(duì)每個(gè)轉(zhuǎn)錄因子制備特異性抗體。具有快速滚秩、高通量专执、節(jié)約時(shí)間成本的優(yōu)勢(shì)，并且適用于大多數(shù)的真核生物郁油。
